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1、GoldScript cDNA 合成试剂盒货号：c81401190 规格：50 次反应保存：-20产品描述GoldScript cDNA 合成试剂盒是为从纯化的 mRNA 或总 RNA 合成第一链 cDNA 而优化设计的，总RNA的使用量可以为 1ngj5g。 cDNA 合成之后，无需有机物抽提或乙醇沉淀，即可用特异引物进行 PCR 扩增。第一链 cDNA 合成反应是由 GoldScript 逆转录酶 (RT) 催化的。此酶经过改造，降低了 RNaseH 活性，从而能够产生更多的全长 cDNA，并且获得的第一链 cDNA 的产量比其它逆转录酶更高。由于 rRNA 和 tRNA 对 GoldSc
2、ript 逆转录酶的抑制作用不明显，所以它能从总 RNA 中高效合成第一链 cDNA。这种酶的热稳定性强，最高能在 50 合成 cDNA。本试剂盒经过优化，能从不同浓度的起始模板中合成第一链 cDNA。在优化过程中，降低了 GoldScript 逆转录酶的浓度，并且添加了重组的 RNase 抑制剂。另外，通过反应条 件的优化进一步提高了系统的灵敏度。应用本试剂盒，可以采用 Oligo (dT)，随机引物，或基因特异引物三种方法对总 RNA 或 mRNA 进行第一链合成。然后用目的基因特异的引物进行 PCR 反应。其它仪器及试剂下面这些仪器及试剂材料需要客户提供： 总 RNA 或 mRNA 可选
3、：扩增纯 DNaseI PCR 所需的 DNA 聚合酶 PCR 仪 高压灭菌的 0.2ml 或 0.5ml 微量离心管或高压灭菌的薄壁 PCR 管 1-20l， 20-200l 移液器及吸头 一次性手套 扩增目的 mRNA 片段的特异引物 微型离心机，最大相对离心力应能达到 14,000g 37、 42、 65 和 70 水浴锅或加热块试剂盒组分组分 量 Oligo (dT) 12-18 (0.5g/l) 50 l随机引物 (50ng/l) 250 l10X RT buffer 200mMTris-HCl 1 ml(pH8.4), 500mM KCl 25mM MgCl2 500 l0.1M
4、DTT 250 l10mM dNTP mix 250 l(10mM each dATP,dCTP,dGTP,dTTP) GoldScript 逆转录酶 (50units/l) 50 ml重组 RNA 酶抑制剂 (40units/l) 100 lE. coli RNaseH (2units/l) 50 lDEPC - 水 1.2 ml对照 RNA (50ng/l) 15 l对照引物 A (10M) 20 l对照引物 B (10M) 20 l应用 Oligo(dT) 或 GSP 引物启动第一链 cDNA 的合成起始模板量：1ng-5g 的总 RNA 或 50-500ng 的 poly (A)+RN
5、A对照反应：使用 1l 的对照 RNA (50ng/l)1. 在使用前将每个组分摇匀并短暂离心。2. 在 0.2- 或 0.5-ml 无菌管中加入下列组分：应用随机引物启动第一链cDNA的合成起始模板量：1ng-5 g 的总 RNA 或 50-500ng 的 poly (A)+RNA对照反应：使用 1 l 的对照 RNA (50ng/ l)1. 在使用前将每个组分摇匀并短暂离心。2. 在 0.2- 或 0.5-ml 无菌管中加入下列组分：组分 样品量RNA n l10mM dNTP mix 1 lPrimer (0.5 g/l) Oligo (dT)12-18，或 2 M GSP) 1 lDE
6、PC- 水 至 10 l组分 样品量RNA n l10mM dNTP mix 1 l随机引物 (0.5 g/l) 1-5 lDEPC- 水 至 10lcDNA 合成建议和指导RNA合成全长 cDNA 的一个重要因素就是分离得到完整的 RNA，总 RNA 的使用量一般为 1ngj5g。如果总 RNA 的量超过 5g，可以增加反应体积，并相应增加 GoldScript 逆转录酶的量。试剂盒中包括 RNaseOUTTM重组的 RNA 酶抑制剂，可以防止 RNA 酶污染对目标 RNA 的降解。我们建议使用 Purelink RNA 小提试剂盒或 TRIzol试剂进行 RNA 提取，或用 PureLin
7、kTM 96 孔总 RNA 提取试剂盒进行高通量 RNA 提取。提取 mRNA 能够改善特定 cDNA 的产量，还可能减少基因组 DNA 的污染，但该步骤是可选的。RNA 制品中经常含有少量的基因组 DNA，它可与目的cDNA 一起扩增。如果您需要在 RNA 制品中彻底避免基因组 DNA 的污染，我们建议使用扩增级的 DNaseI 对 RNA 制品消化 (货号：18068-015)。RNaseH消化通过 RNaseH 消化去除 cDNA:RNA 杂合分子中的 RNA 模板，可增加 cDNA 在 PCR 过程中的灵敏度 (特别是长链模板) 。在第 一链合成过程中 RNaseH 的存在会降解模板
8、mRNA，使合成 的全长 cDNA 的量减少，并且会降低 cDNA 的产量。GoldScript cDNA 合成试剂盒只在需要时引入 RNaseH 的活性。有三种方法可以启动第一链 cDNA 的合成。随机引物法，Oligo (dT)法，基因特异的引物 (GSPs) 法：1.当某一 mRNA 难以完整复制时，通常使用低特异性的随机六聚体引物。使用这种方法，所有的 RNA 都是第一链 cDNA 合成的模板，在 PCR 过程中引物赋予扩增产物的特异性。为了提高合成的 cDNA 的长度，需要根据经验判断引物和 RNA 模板的比例。注意：对于大部分 RT-PCR 反应，5g 的总 RNA 使用 50ng
9、随机引物是足够的，增加引物浓度到 250ng，可以提高短片段 PCR 产物 (500bp) 的产量，但是会降低长片段 PCR 产物和全长转录本的产量。2.Oligo (dT) 引物的特异性更高，也更常用。它可与在绝大多数真核生物 mRNA 中存在的 poly (A) 尾杂交。由于poly (A)+RNA 大约占总RNA的 1%-2%，所以与随机六聚体引物相比，用 Oligo (dT) 作为引物所合成的 cDNA 的量和复杂性要低很多。注意：在对新的 mRNA 分子进行 RT-PCR 时，建议使用Oligo (dT)，而不是随机六聚体或 GSP 作为引物合成第一链cDNA。3.GSP 引物含有目
10、的 cDNA 的序列信息，是最特异的引物。在合成第一链时，可用与 mRNA3 最末端相杂交的 PCR 引物来启动合成。然而，有些 GSP 引物在以 DNA 为模板时可以进行 PCR 扩增，但是不能启动 cDNA 的合成。如果 GSP 引物在 RT-PCR 时失败，那么使用 Oligo (dT) 引物重新进行第一链合成。引物目标 cDNA 的扩增前一步骤所获得的 cDNA 可直接用于 PCR 扩增。建议使用10% 的第一链反应产物 (2l) 进行 PCR。对于一些反应，将cDNA 模板的量加到 10l 可能会增加产物的量。除了 Taq DNA 聚合酶，Invitrogen 还提供了下面这些高特异
11、性或/ 和高保真度的酶：PlatinumTaq DNA 聚合酶，是热启动酶，最长可扩增 4kb的片段，并且能够提高引物的特异性和灵敏度。PlatinumTaq 高保真 DNA 聚合酶，最长可扩增 15kb 的目的片段，可以提高产物的产量和保真度。PlatinumPfx DNA 聚合酶，可扩增 12kb 的片段，具有高保真性，保真度是 TaqDNA 聚合酶的 25 倍。3. 将上述 RNA / 引物混合物放置在 65 ，孵育 5 分钟，然后放置在冰上至少 1 分钟。4. 在另一管中，配制 2X 反应混合液，按顺序加入下列组分：5. 向第 3 步的每个 RNA/ 引物预混液中加入 9l 2X 反应
12、预混液，轻柔混匀，短暂离心。6. 42 孵育 2 分钟。7. 在每个管中加入 1l GoldScript RT，无 RT 对照加入 1l DEPC- 水。8. 42 孵育 50 分钟。9. 70 孵育 15 分钟，终止反应。冰上冷却。10. 短暂离心收集反应。向每个管中加入 1l RNaseH, 37 孵育 20 分钟。-20 保存或 PCR。3. 将样品放置在 65 ，孵育 5 分钟，然后放置在冰上至 少 1 分钟。4. 在另一管中，配制2X 反应混合液，按顺序加入下列组分：5. 向第 3 步的每个 RNA/ 引物预混液中加入9l 2X 反应预混 液，轻柔混匀，短暂离心。6. 室温 (25
13、) 孵育 2 分钟。7. 在每个管中加入 1l GoldScript RT，无 RT 对照加入 1 l DEPC- 水。8. 室温孵育 10 分钟。9. 42 孵育 50 分钟。10. 70孵育 15 分钟，终止反应。冰上冷却。11. 短暂离心收集反应。向每个管中加入 1l RNaseH, 37 孵育 20 分钟。-20 保存或 PCR。组分 1个反应 10个反应10RT 缓冲液 2 l 20 l25 mM MgCl2 4 l 40 l0.1M DTT 2 l 20 l重组 RNase 抑制剂 (40U/ l) 1 l 10 l组分 1个反应 10个反应10RT 缓冲液 2 l 20 l25
14、mM MgCl2 4 l 40 l0.1M DTT 2 l 20 l重组 RNase 抑制剂 1 l 10 l问题 可能的原因 建议的方案扩增产物电泳分析后无条带第一链 cDNA 合成过程中的步骤错误RNase 污染RNA 的多糖共沉淀目标 mRNA 包含强的转录终止区域PCR 中使用了太多的第一链产物第一链合成中使用了 GSPRT 的抑制剂存在基因组 DNA 的污染引物的非特异退火引物形成 二聚体使用对照 RNA 来验证第一链反应的效率。在样品中加入对照 RNA，以确定第一链反应中是否存在 RNase。维持无菌条 件，预防 RNase 污染。在第一链反应中使用重组 RNase 抑制剂。用氯化
15、锂沉淀 RNA，以去除多糖。在第一链反应中用随机六聚体取代 Oligo (dT)。退火步骤后维持一个较高的温度 ( 高 GC 含量转录本的第一链 cDNA 合成) 。提高第一链反应的温度 ( 高达50 ) 。使用更靠近目标 cDNA 3 端的 PCR 引物。使用不超过 1/10 的第一链反应。尝试另一个 GSP 或转换成 Oligo (dT)。确保 GSP 是反义序列。在第一链反应前，通过 mRNA 的乙醇沉淀去除抑制剂。包括用 70% (v/v)的乙醇对 mRNA 沉淀进行洗涤。注意：R T 的抑制剂包括十 二烷基硫酸钠(SDS)、 EDTA、胍盐、甲酰胺、焦磷酸钠和亚精胺。将 1g 对照 RNA 与 1g 样品 RNA 混合，并比较第一链 cDNA 的产量，来检验抑制剂的存在。预处理 RNA。设计与 mRNA 内含子两端的外显子或外显子/ 外显子边界的序列退火的引物，以区分 cDNA 的扩增和基因组DNA 潜在的污染产物。为检测产物是否来自 DNA，开展无 RT 对照。改变退火条 件。使用 Plat
