《RNA干扰技术抑制EC109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RNA干扰技术抑制EC109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1RNA 干扰技术抑制 EC109 细胞 survivin 基因表达及其促凋亡研究【摘要】 目的：应用 RNA 干扰技术（RNAi）研究针对 survivin基因的 siRNA，抑制 survivin 基因的表达并诱导食管癌细胞系EC109 细胞的凋亡 . 方法：构建针对 survivin 的 siRNA 表达质粒，转染至 EC109 细胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质印迹和半定量 RTPCR 检测 survivin 蛋白表达及基因转录水平的变化，并在不同时间点收集转染细胞，利用流式细胞术及基因组 DNA 凋亡检测试剂盒，观察 siRNA 抑制 survivin 基因表达后诱导细胞凋亡的情况
2、. 结果：荧光显微镜结果表明，重组质粒转染效率达 46.70. 半定量 RTPCR 检测到 pSIREN/S 质粒在 EC109 细胞内对 survivin基因的转录抑制率为 74.04%；蛋白质印迹结果表明，转染重组质粒 pSIREN/S 的 EC109 细胞 survivin 蛋白表达量仅为正常组的41.64%，而对照质粒 pSIREN/CN 对 survivin 基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. 经 pSIREN/S 转染的 EC109 细胞基因组 DNA出现明显的 DNA ladder，流式细胞仪分析结果也显示凋亡细胞为60.78%. 结论：survivin 特异性 siRNA 可
3、明显抑制 survivin 基因的转录和表达，并能有效地诱导 EC109 细胞的凋亡，为下一步在体内利用 pSIREN/S 重组质粒沉寂 survivin 基因，促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础. 【关键词】 RNA 干扰技术 食管肿瘤 survivin 基因 EC109 细2胞 0 引言 潮汕地区是中国六大食管癌高发区之一，据统计，广东省南澳县恶性肿瘤死因构成的排位顺序为食管癌最高，占恶性肿瘤死亡总数的半数以上1 . 因此对于食管癌特别是中晚期患者，寻找有效的治疗手段至关重要. survivin 是 IAP（inhibite apoptosis protein）家族成员之一，具有抑制凋亡的作用；
4、同时也是细胞周期调节蛋白，通过干扰细胞的有丝分裂以调节细胞的凋亡2. 已有文献3-5报道，食管癌患者的肿瘤组织中 survivin 的表达明显高于正常组织，我们利用 siRNA 技术，以食管癌 EC109 细胞株为模型，利用 survivin 特异性 siRNA，对 survivin 基因的转录、表达及其诱导 EC109 细胞凋亡进行了研究 . 1 材料和方法 1.1 材料 人食管鳞癌细胞株 EC109 为汕大医学院沈忠英教授馈赠. 大肠杆菌 DH5 及 RNAi 载体质粒RNAiReadypSIRENDNRDsRedExpression 购自Invitrogen 公司. RPMI1640、小
5、牛血清、胰蛋白酶等购自 Sigma公司. 脂质体 Lipofectamine2000 购自 Invitrogen 公司. 兔抗人survivin 单抗购自 Santa Cruze，CY3 标记的羊抗兔 IgGFc 抗体购自武汉博士德公司. 限制性核酸内切酶 EcoR I，BamH I 等购自NEB 公司. T4 DNA 连接酶、DL 2000 标准 Marker 由 TaKaRa 公3司提供. 质粒提取试剂盒购自上海博光生物技术有限公司. RNaeasy Kit 购自 Qiagen 公司. 1.2 方法 1.2.1 抑 survivin siRNA 序列及载体构建 根据 survivin 的编
6、码序列及以往的研究资料，结合 siRNA 序列设计原则并利用 Blast 进行查询，确定其为特异性 survivin RNA干扰的靶序列, 其正义链: 5 gat cca aag cat tcg ggt tgc ttc aag acg gca acc gga cga atg ctt ttt ttt tga att ca 3, 反义链: 3 agc ttg aat tca aaa aaa aag cat tcg tcc ggt tgc cgt ctt caa gca acc gga cga atg ctt tg 5. 为排除 siRNA 本身的影响，我们设计了无关的 siRNA 序列，CN 序列
7、，即正义链为：5gat ccg act tca taa ggc gca tgc ttc aag acg gca tgc gcc tta tga agt ctt ttt tgt cga ca3，反义链为：3gct gaa gta ttc cgc gta cga agt tct gcc gta cgc gga ata ctt cag aaa aaa cag ctg ttc ga5. 所有的寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成. 退火后分别插入经 BamH I 和 EcoR I 线性化的载体 pSIREN 中，构建重组载体 pSIREN/S 和 pSIREN/CN. 转化大肠杆菌 D
8、H5，挑取氨苄青霉素抗性菌落并扩增培养，然后快速小量制备质粒并进行核酸测序鉴定，选择序列正确的克隆扩大培养. 1.2.2 细胞培养与转染 EC109 细胞株常规培养于 RPMI1640 培养基中，每 23 d 经 2.5 g/L 的胰酶消化，传代培养. 采用 LipofectamineTM 2000 (Invitrogen)脂质体转染法4转染，操作流程按照说明书进行. 将正常培养的 EC109 细胞用胰酶消化，1000 r/min 离心 5 min，以 2108 个细胞/L 重悬于培养基，2 mL/孔接种于六孔板中，待细胞生长密度约为 70%80%时，更换无血清、无抗生素培养基. 实验分为三组
9、，即 pSIREN/S, pSIREN/CN 和未转染对照组. 转染后 6 h 更换正常培养基，12 h后在荧光显微镜与流式细胞仪下观察 DsRed 的表达，推测转染效率. 1.2.3 半定量 RTPCR 检测 EC109 细胞 survivin mRNA 的表达分别于转染后24，36，48，72 和 96 h 收集 pSIREN/S 细胞及 pSIREN/CN 和未转染对照组细胞各 2106 个，PBS 洗涤两遍，提取各组细胞总RNA. 逆转录引物采用 Uni12 和 PolyT 进行，在 RTPCR 反应体系中加入二对引物， 第一对是内源对照 GAPDH (3361235 bp)，5cga
10、 agg tga agg tcg gag tc3和 5gac cac ctg gtg ctc agt gt3，第二对是被沉寂的目的基因的引物，即 survivin (9911500 bp)， 5ata gtc gac atg ggt gcc ccg acg ttg3和5ctc gga tcc tca atc cat ggc agc cag3. 扩增片段为 509 bp. 具体操作过程参照逆转录试剂盒说明书. 利用 GeneTools 软件测定GAPDH 及 survivin 的 A 值，结果以其和内参照 GAPDH 的 A 值来反映其相对含量，确定 survivin 基因在不同时间点被 siR
11、NA 沉寂的程度. 1.2.4 免疫荧光染色 5生长在盖玻片上的细胞用 40 g/L 多聚甲醛室温下固定 20 min， 0.5 g/L 胰酶、30 mL/L 过氧化氢(甲醇配制)各处理 30 min后，正常羊血清封闭 30 min. 加入一抗（兔抗人 survivin，Santa Cruze, 1200） 4湿盒过夜，PBST 漂洗后，加入二抗（Cy3标记的羊抗兔 IgG，博士德，1100） ，室温下染色 1 h，漂洗后荧光倒置显微镜下观察并照相. 1.2.5Western Blot 检测 EC109 细胞 survivin 蛋白的表达收集各组细胞，PBS 洗涤 2遍，细胞裂解液裂解细胞，提
12、取总蛋白，紫外分光光度计法进行蛋白质定量. 安装垂直电泳仪，配制 100 g/L SDS 分离胶及浓缩胶，取 60 g 样本上样. 电泳后用电转仪恒流（35 mA）转移蛋白 3 h后，取出转印膜（NC 膜） ，丽春红 S 染液染色，再经 50 g/L 脱脂牛奶封闭、兔抗人 survivin 一抗 4孵育过夜，TBST 洗膜，加入13000 羊抗兔 IgG/HRP，室温孵育 2 h，用辣根过氧化物酶/LumiGLO 化学发光法进行 Western 检测. 1.2.6 提取基因组 DNA，电泳观察 DNA ladder 的形成 收集待测细胞用 PBS 洗 1 次. 按试剂盒说明提取基因组DNA.
13、行 20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相、观察. 1.2.7 流式细胞仪检测 转染细胞凋亡分别收集各组细胞 1106 个，PBS 洗涤 3 次后 700 mL/L 乙醇固定，PBS 洗涤后用 2 mL/L Triton100 破细胞膜，再加入 PI 染液及 RNase 避光染色 30 min. 流式细胞仪检测细6胞凋亡情况. 统计学处理：所有实验均重复 3 次，采用计算机统计分析软件 SPSS11.0 对半定量 RTPCR 数据进行配对 t 检验. 各处理组与正常对照组进行比较，P0.05 即认为有统计学差异 . 2 结果 2.1 质粒图谱、转录产物及重组子的的鉴定 siRNA 表达载体
14、及其多克隆位点(图 1)和在 U6 启动子的作用下所表达的小发夹 RNA（small hairpin, shRNA，图 2）中有 19个正义与反义核苷酸序列，两者以 9 个核苷酸的 loop 环相连. siRNA 转录后，折叠形成如图所示的 dsRNA 发夹样结构. pSIREN/S 采用 EcoR I 和 BamH I 进行酶切鉴定，经双酶切后产生一个约 100 bp 的片段. 筛选阳性克隆质粒送测序，测序结果完全吻合，表明构建重组子完全正确. 2.2pSIREN/S 真核载体的转染及阳性克隆的鉴定 用阳离子脂质体转染法，将重组体 pSIREN/S 和pSIREN/CN 分别转染至 EC10
15、9 细胞中，观察红色荧光表达量. 除空质粒对照组细胞呈现阴性外，pSIREN/S 和 pSIREN/CN 实验组在转染 12 h 后可见荧光蛋白表达且在整个细胞中均匀分布，24 h后明显，4872 h 达高峰. 经流式细胞仪观察表达 DsRed 的阳性细胞可达 46.7(图 3). 2.3survivin mRNA 表达的变化 转染 pSIREN/S 后，EC109 细胞的 PCR 产物电泳条带较对7照组明显减弱，而不影响 GAPDH 的表达，而转染阴性对照质粒的EC109 细胞无明显改变( 图 4). 转染 pSIREN/S 后 EC109 细胞mRNA 表达量随时间增加而减少，72 h 达
16、到高峰. 应用GeneTools 图像系统分析结果，分别得出各组 GAPDH 和 survivin的 A 值，用 H 检验进行分析. H 检验分析可见，转染 pSIREN/S 36 h 后 EC109 细胞 mRNA 表达量与转染前（正常 EC109 细胞对照组）之间的差异有显著意义（n=3, P0.01, 表 1）. 36, 48, 72及 96 h Suvivin mRNA 的量仅为正常对照组的 57.17%, 64.17%, 25.96%和 27.55%.表 1GeneTools 图像系统分析(略) 2.4 免疫荧光染色分析 转染前后 survivin 的表达变化未转染细胞对照组和pSIREN/CN 的细胞均呈上皮性贴壁生长，细胞轮廓清晰、透亮无颗粒，形态一致，细胞间结构紧密，生长旺盛；转染 pSIREN/S 组的细胞于
