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1、1RNAi 技术在医学领域的研究进展【摘要】 RNAi 是利用内外源 mRNA 沉默目标基因的现象，目前已经应用于临床疾病的治疗。本文主要讲述 RNAi 在病毒性、遗传性、肿瘤疾病治疗方面的应用，展现二十一世纪医学领域中治疗手段发展的新突破。 【关键词】 RNAi 医学 治疗 RNAi（RNA interference，RNAi ）即 RNA 干涉，是生物体内普遍存在的一种生物学现象，是由双链 RNA（dsRNA）参与指导的，在特定酶的参与下以外源和内源 mRNA 为降解目标的转基因沉默现象。在过去几十年里 RNAi 一直是生物科学中的一个亮点，人们通过向有机体引入小片段干涉 RNA 分子（s
2、mall interfering RNAs，siRNAs）和发夹样 RNA 分子（small hairpin RNAs，shRNAs）能够特异地降解目标 mRNA 这一特性来探索基因功能。这种方法较传统的基因敲除更加有效、方便。随着基因载体稳定性的不断改进和提高，构建干涉载体已趋于成熟，RNAi 便成为决定基因功能中优先选择的手段。RNAi 广泛存在于许多的生物体内，如线虫、果蝇、蛇、斑马鱼、青蛙、老鼠和人等1。作为一种新兴的技术，它有着广泛的应用前景。着眼于目前的研究状况，RNAi 具有毒副作用小、作用迅速、特异性高等优点，因此在医学领域开展 RNAi 是实现基因治疗的一种有力手段。它可以用
3、于抑制异常基因表达，有效治疗癌症及遗传病等人类顽症，但是在临床试2验开始之前仍需谨慎，必须要考虑到长期应用 RNAi 后引发毒副作用的可能性，以及用后机体各项生理指标有无改变，免疫系统有无影响等。本文下面就针对 RNAi 在医学领域的主要研究进展进行介绍。 1 RNAi 的发现史 早在 1990 年的转基因植物研究中，人们发现将全长或部分基因导入植物细胞后会引发某些内源基因不表达，但这些基因的转录并无影响，当时将这种现象称为基因转录后沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS) 。1996 年科研人员首次在线虫中发现dsRNA 能够导致基因沉默，因此又
4、将该现象命名为基因表达的阻抑作用(quelling)2。当年康乃尔大学的研究人员 Guo 和 Kemphues为探讨基因功能，想利用反义链 RNA 来特异性地阻断 par-1 基因的表达，然后设立了对照组实验以期正义链 RNA 能使目标基因的表达量增加。但结果却显示二者都同样的阻断了 par-1 基因的表达。这个现象直到 3 年后才被解开 -华盛顿卡耐基研究院的 Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的 Craig Mello 通过大量的实验得知，无论是单纯的反义链还是正义链 RNA 都不能阻断基因的表达，而起阻碍作用的是体外转录的 RNA 样品中混有的微量 dsRNA。实验结果显示，纯
5、化后的单链 RNA 对基因表达的抑制作用是很微弱的，而 dsRNA 正好相反，因此他们将 dsRNA 能引发相应基因表达阻断的现象定义为 RNAi。 2 RNAi 在医学领域的应用 32.1 治疗病毒性疾病 病毒性疾病的防治始终困扰着医学工作者，并给人类的健康带来巨大危害。由于 RNAi 能从源头有效地抑制病毒抗原基因的表达，因此在病毒性防治方面较疫苗防治、药物治疗更优越，为传染性疾病的防治带来希望。近些年来，RNAi 技术在多种病毒性疾病的防控研究上取得了一定的进展。 艾滋病又叫“获得性免疫缺陷综合征” （AIDS）是人体感染了人类免疫缺陷病毒（HIV）所导致的传染病。MIT 的 Novin
6、a 最早利用 RNAi 来对付 HIV，开启了利用 RNAi 治疗病毒性疾病的先河。研究发现，在慢病毒载体中加入抗 HIV ShRNA（anti-HIV ShRNA） 、抗 CCR5 核酶（ anti-CCR5 ribozyme）和核仁内反式激活反应元件类似物（uncleolar-localizing TAR decoy）基因的串联组合，可以长时间的抑制 HIV。证明了 RNAi 具有治疗艾滋病的功能3。 乙型肝炎和丙型肝炎是经血液传播的危害性严重的病毒性传染病，分别由乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（ HCV）感染而起。自 2003 年以后，应用 RNAi 治疗乙肝、丙肝的研究也逐渐增多
7、。2005 年 Sirna 治疗学公司（Sirna Therapeutics）宣布实现了RNAi 应用于治疗中的重大突破，成功抑制了乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）在人体内的表达。研究发现，应用短发夹 RNA 载体可以抑制哺乳动物肝脏细胞中 HBV 的复制起始，同时siRNA 也可以有效抑制 HBV 的复制。根据这种研究思路，人们利4用 RNAi 抑制了 HCV 在人体内的复制。这些研究都证明了 RNAi 在抗病毒方面的优势作用4。 此外，Nobel 医学奖获得者 Phillip Sharp，已成功在 2005 年开发出用来治疗呼吸道合胞病毒、流行性感冒的 RNAi
8、药物。同期中国旅美生物医学博士陆阳和 Intradigm 公司分别在 Nature 发表文章阐述 siRNA 剂对恒河猴 SARS 冠状病毒（SCV）呼吸道感染能起到预防和治疗作用。RNAi 目前已经成为治疗病毒性疾病的一种有效手段，但在稳定性、安全性等问题上还有待深入研究。 2.2 治疗遗传性疾病 随着 RNAi 现象的发现以及对它的分子生物学机制的深入探讨，利用 RNAi 解决人类遗传性疾病已经不再遥远。2002 年，美国和日本的研究人员 Carthew R W、Ishizuka A 等人几乎同时发现 RNAi与脆性染色体综合征的关系，这预示机体内 RNAi 机制缺失会导致人类遗传性疾病5
9、, 6。此后在对抗人类遗传性疾病研究中，RNAi 成为广泛采用的手段。人们不久发现，RNAi 在治疗人类神经系统疾病方面有优于其他治疗方法的特点。其中神经变性疾病是由于单个基因显性突变而引起的遗传性疾病。目前已有许多神经变性疾病如亨廷顿病(Huntingtons disease)、脊髓延髓肌肉萎缩症、帕金森病、肌萎缩性（脊髓）侧索硬化（ALS） 、阿尔茨海默症等都可以通过 RNAi 来抑制突变基因表达。 可以看出 RNAi 在遗传性疾病治疗方面拥有巨大的潜力，但如何透过血液将 siRNA 送达效用部位还是急需解决的一个难题，我们坚5信在医学科研人员的努力下，一项成熟的基于 RNAi 的治疗技术
10、将用于临床实践。 2.3 治疗肿瘤疾病 肿瘤疾病的本质属于“基因病” ，恶性肿瘤的侵袭和转移是临床上绝大多数肿瘤患者的致死原因，肿瘤发生过程主要是原癌基因、生长因子异常高表达和肿瘤抑制因子突变的结果，故从基因水平解决肿瘤疾病是最佳的。siRNA 能够高效、特异地抑制原癌基因及癌相关基因的表达，目前已成为临床上肿瘤防治研究的有力工具。但从当前的研究状况看，要利用 RNAi 策略解决肿瘤治疗问题，首先要解决靶基因的选择及 siRNA 向体内的定向输送。采用逆转录病毒系统可以有效地将 siRNA 插入肿瘤细胞基因组中并长期存在，解决了 siRNA 作用时间短，实际操作困难等缺点。Wenping Li
11、7等人利用腺病毒介导的 siRNA 转染使 PBR mRNA 下降 50%，细胞分裂增殖停止，从而抑制肿瘤的生长，故 PBR 可作为治疗人乳腺癌潜在的靶标。Menendez 等人将与靶基因 FAS mRNA 序列相对应的siRNA 转染到培养的人子宫内膜癌细胞中 72h 后，发现 FAS 基因表达下降 90%，从而成功的抑制了子宫癌细胞的生长8。 目前，利用 RNAi 对肿瘤进行研究与治疗还存在很多问题，是否所有肿瘤细胞中 RNAi 现象都存在，是否某些肿瘤细胞中的 RNAi现象是被抵抗的，是否人体内肿瘤细胞的 RNAi 现象和动物模型实验中呈现的效果是相符的，人类攻克肿瘤问题还需很长的历程，
12、无疑 RNAi 为肿瘤的治疗提供新的思路和策略。 63 RNAi 的前景展望 RNAi 作为一种代替基因敲除的遗传工具，可以有效地对基因进行功能评价。该技术正改变着功能基因组学的研究步伐。 科学杂志和美国科学促进会已将 RNAi 技术评选为 2002 年十大重大科学成就之首。由于 RNAi 技术的日益发展，它已经迅速地从实验室研究迈向了临床应用。目前，几种真正意义上的 RNA 干扰药物已经进入了临床实验阶段。相对于近些年大力发展的基因治疗、反义核酸技术、生物芯片等新兴生物技术来说，RNAi 无疑将会给医学界带来更具潜力的突破和发展。但值得人们注意的是 RNAi 在哺乳动物中的研究还具有一定的限
13、制性，比如在哺乳动物的某些细胞中RNAi 作用并不显著，特别像一些神经细胞。而且通过运载体将dsRNA 转入人体进行基因治疗还是一个很大的难点。可喜的是利用腺病毒作运载体的实验目前已经取得成功，人们还在寻求一种更加稳定和安全的运载体9。二十一世纪是基因的时代，更是生命科学的时代，RNAi 的发现无疑是这一时代医学领域的一个崭新突破，它为解决人类疾病开辟新的篇章。 参 考 文 献 1Jorgensen RA,Culster PD,English J.etal.Chalcone synthase cosupp-ression phenotypes in petunia flowers: compa
14、rison antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequencesJ.Plant Mol Biol, 1996,31(5):957-970. 2FIRE A, XU S, MONTGOMERY M K,et al, Potent and 7specific genetic interference by double- standed RNA in Caenorhabditis elegans J. Nature, 1998, 39:806-811. 3Li MJ，Kim J,Li S，et al. Long-term
15、inhibition of HIV-1 infection in primary hematopoietic cells by lentiviral vector delivery of a triple combination of anti-HIV shRNA, anti-CCR5 ribozemy ,and a nucleolar TAR decoy. MOLECULAR THERAPY, 2005, 12(5):900-907. 4McCaffrey AP,Nakai H,Pandey K, et al. Inhibition of hepatitis B virus replicat
16、ion by RNA interference. BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, 2003, 309(2):482-483. 5Carthew RW. RNA interference: the fragile X syndrome connectionJ. Current Biology, 2002, 12(24):852-854. 6Ishizuka A, Siomi MC, Siomi H. A drosophila fratile X protein interacts with components of RNA and ribosomal proteinsJ. Genes & Development, 2002,16(19):2497-2508. 7Wenping Li, Matthew J. Hardwick. Peripheral-type b
