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1、酶 学,彭益强,Enzymology,国立华侨大学生物工程与技术系,第一节 单底物反应动力学第二节 抑制作用动力学第三节 多底物反应动力学第四节 别构酶动力学第五节 pH和温度对酶催化反应速度的影响,主要内容,第四章 酶催化反应动力学,第二节 抑制作用动力学,变性作用:破坏酶蛋白的次级键,部分或全部改变酶的三级结构;抑制作用:某些化学试剂不引起变性,但能使酶蛋白分子上某些必需基团化学性质发生变化,引起酶活力降低或丧失;抑制剂:凡能降低酶催化反应速度的物质都称之为.特性:与酶的必须基团(包括活性基团及辅基)结合；改变影响其结构与性质，引起酶反应速度下降；它对酶有选择性，不包括酶蛋白的水解及变性失
2、活作用。研究意义：对生物机体代谢途径、药物作用机理、酶活性中心内功能基团性质、酶构象维持基团性质、底物专一性、酶作用机理等研究的促进作用。,抑制剂对酶活性的影响,抑制类型分类,1、不可逆抑制作用(irreversible inhibition),与时间有关,指抑制剂与酶的活性中心发生了化学反应，抑制剂共价地连接到酶分子的必需基团上，阻碍了底物的结合或破坏了酶的催化基团，不能用透析或稀释的方法使酶活性恢复。,不可逆抑制作用相当于失活的酶浓度。,又分专一性和非专一性不可逆抑制两类；前者和活性部位基团反应，后者和一类或几类基团反应；区分不是绝对的；非专一性抑制剂用途更广；,2、可逆抑制作用(reve
3、rsible inhibition),与时间无关；抑制剂与酶蛋白以解离平衡为基础,以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过物理方法(如透析等)被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性,这种作用称为可逆抑制作用。,可逆与不可逆的区分,(1),一定量抑制剂与酶溶液混合，预保温后取不同量的混合液测定其初速，用反应初速度对酶浓度作图：,区别（一）,(2),抑制剂一定量，用不同酶浓度测活，同（1）作图,区别（二）,消除不可逆抑制剂,不可逆,可逆,斜率减小,（3）抑制剂不同量，作初速度与酶浓度关系图,区别（三）,v,E,I,I3,I2,I1,I0,I0,I1,I2,I3,消除不可逆抑制剂,非专一
4、性不可逆抑制,非专一性不可逆抑制剂可对酶分子上每个结构残基进行共价修饰而导致酶失活。这类抑制剂主要是一些修饰氨基酸残基的化学试剂，可与氨基、羟基、胍基、酚羟基等反应，如烷化巯基的碘代乙酸等，重金属Hg2+、Pb2+、Cu2+、三价砷等。,一、不可逆抑制作用,（一）非专一性不可逆抑制剂,1、酰化试剂:酸酐、乙酰咪唑等，作用基团：氨基、羟基、酚基、巯基2、烷化试剂：带有活泼卤素原子，易烷化亲核侧链基团，2，4-二硝基苯氟等，作用基团：氨基、巯基、羧基、硫醚等；其中最主要的是含卤素的化合物，如碘乙酸、碘乙酰氨、卤乙酰苯等。它们可使酶中巯基烷化，从而使酶失活。常用作鉴定酸中巯基的特殊试剂。,巯基酶 碘
5、乙酸胺 失活的酶,3、有机磷化合物：能与酶活直接相关的丝氨酸上的羟基结合，抑制蛋白酶与酯酶；例：抑制神经系统的胆碱酯酶，使乙酰胆碱不能分解而堆积引起神经中毒，二战中使用的毒气DFP，有机磷杀虫剂（敌百虫）:由于乙酰胆碱堆积，使神经处于过渡兴奋状态，引起功能失调，导致中毒。如昆虫失去知觉而死亡；鱼类失去波动平衡致死；人、畜产生多种严重中毒症状以至死亡等。但对植物无害故可在农业、林业上用作杀虫剂。(有机磷化合物有时可用含CHNOH基的肟化物，或羟肟酸RCHNOH化物将其从酶分子上取代下来，使酶恢复活性。故将此类化台物称为杀虫剂解毒剂，如常用的解磷啶（PAM）就是其中的一种。),非专一性不可逆抑制剂
6、,4、亲电试剂：缺乏电子试剂，有氧化能力，四硝基甲烷作用基团：酚基,非专一性不可逆抑制剂,5、有机汞、有机砷化合物：和巯基作用；(1)对氯汞苯甲酸;加入过量巯基化合物如半胱氨酸解除；,路易斯毒气作用机制,(2)三价有机砷与辅酶硫辛酸作用，抑制了丙酮酸氧化酶系统，可被过量双巯基化合物如二巯基丙醇解除；,非专一性不可逆抑制剂,6、氧化还原剂：光敏剂氧化，作用于巯基、硫醚基、酚基等。还原剂有巯基乙醇等，作用于巯基。7,氰化物与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合，使酶失活而阻抑细胞呼吸。木薯、苦杏仁、桃仁、白果等都含有氰化物，以及工业污水和试剂中的氰化物等进入体内，均可造成严重中毒。临床上抢救氰化物中毒时，
7、常先给注射亚硝酸钠使部分HbFe2+氧化生成HbFe3+，而夺取与细胞色素氧化酶（Cyt a3）结合的CN-，生成HbFe3+CN-，再注射硫代硫酸钠，将由HbFe3+CN-中的CN-逐步释放，在肝脏硫氰生成酶的催化下转变为无毒的硫氰化物，随尿排出，从而解除其抑制。,8,重金属Ag+、Hg2+、Pb2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+等;在高浓度时可使酶蛋白变性失活，低浓度时可与酶蛋白的巯基、羧基和咪唑基作用而抑制酶活性。应用金属离子螯合剂如EDTA、半胱氨酸或焦磷酸盐等将金用离子螯合，可解除其抑制，恢复酶活性。 9,青霉素抗菌素类药物，与糖肽转肽酶活性部位Ser-OH共价结合，使酶失活。,非专
8、一性不可逆抑制剂,10、生物自由基对酶类的作用自由基（Free radical，FR）是指能独立存在的含有一个或一个以上未配对电子（即外层轨道上具有奇数电子）的原子、原子团、分子或离子。未配对电子的存在赋予自由基以顺磁性和高度化学反应活性的特点，且总有变为成对电子的倾向，因而性质极不稳定，常易发生丧失或得到电子的氧化还原反应。 其中作用最广、研究最多的当属含氧自由基（或称活性氧），过量自由基产生可造成机体细胞非特异性氧化损伤，如引起DNA碱基修饰、链断裂、酶蛋白变性失活等，从而关联到多种疾病病理生理过程。,非专一性不可逆抑制剂,生物自由基对酶分子的不可逆抑制作用是广泛的。例如，可修饰GSH-P
9、X活性部位的一个巯基与其相邻的Se元素，攻击活性部位的SH使之失活。在酶蛋白分子中，蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和苯丙氨酸等最易受到自由基的攻击而被氧化，这是由于它们具有不饱和性质，如组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚羟基、色氨酸的吲哚基等。,酶不可逆抑制动力学判断必需基团性质和数目,建立于动力学基础上,按伪一级反应处理;方法核心:分别测定蛋白质修饰反应中,基团被修饰的反应速度和蛋白质失活的反应速度,用半对数法比较两者反应速度常数,判断必需基团性质和数目。,1,Ray-Koshland法,2，邹氏作图法,以统计学为基础，根据必需基团与非必需基团与试剂作用的反应速度和其它性质不同将化
10、学修饰分六种：（1）修饰试剂仅作用于一类基团且必需基团与非必需基团作用速度相等；（2）同类基团中，必需基团与非必需基团作用速度相差很大；（3）同类基团中，必需基团与非必需基团作用速度不等但相差不大；（4）必需基团已全部被除修饰的酶分子尚有残余活力aT;（5）同类基团中保留其中之一即保有全部活力；（6）试剂作用于两种不同侧链基团，二者均含有必需基团；本是描述蛋白质功能基团的化学修饰与其生物活性之间定量关系，也可用来判断必需基团的性质和数量；,邹氏作图法,判断必需基团的性质和数量可通过测定酶活力降低程度和侧链基团被破坏程度之间的关系加以分析得出；邹氏作图法：(第（1）种情况例)测定不可逆抑制剂作用
11、过程的酶活力剩余分数a的同时测定某一种必需基团的剩余分数x；同类基团有i个是必需的，若这些基团反应速度相等，只有那些i个必需基团都没有被破坏的酶才能保存活力,取对数得：,法一：剩余活力百分数i次方根与基团剩余百分数作图有直线关系，以lga对lgx作图得一条直线，从而求出该必需基团的数目。,法二：假设一系列i值，以a1/ix作图，能获得直线的i即为必需基团数目；,i=1,i=2,对羟基甲酰甲醛修饰牛胰核糖核酸酶,（二）专一性不可逆抑制作用,根据底物的化学结构设计，具有和底物类似的结构，还带有能和活性部位其它基团结合的基团，又称亲和标记试剂；选择性来源于与活性和非活性部位形成络合物的解离常数比值；
12、,1、Ks型不可逆抑制,Ks型的判断,（1）化学计量，酶活全丧失；（2）底物、竞争性抑制剂具保护作用；（3）使酶可逆失活，失活后即不与不可逆抑制剂作用。,应用,通过对酶蛋白亲和标记来研究酶活性中心结构；原理：抑制剂上引入特殊光学性质的基团，而这些基团可反应酶分子局部微环境区的不同，称之为“报告基团”。,例：,胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶的底物与不可逆抑制剂比较。前者底物有一带正电荷的侧链，后者底物要求具一芳香性的侧链；Ia（对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮）,IIa是抑制剂，Ib（对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰甲酯）,IIb是底物；Ia和IIa ， Ib和IIb具相同结合基团，不同的是Ia，IIa具一个活泼
13、氯甲基，被羰基活化后可作为烷化剂与酶活性部位基团作用。图4-14.,RCCHCl2,RCCH3,抑制剂,底物,2、Kcat型不可逆抑制剂,根据酶催化过程设计；对酶作用机制有预了解；与底物相似的与酶结合和被酶催化反应性质，还具一个潜伏基团；潜伏基团活化与活性中心共价结合使之停留在此结合状态，不能再分解生成产物，酶因而致“死”，此过程称酶“自杀”失活作用。Ss为自杀性底物，Is为Ss被酶催化后的抑制物，过程如下：,特点：,Ss单纯与E结合还不能成为抑制剂，只有转化为产物I后Is后才可；Kcat越大生成产物数也越快，抑制作用越强；Kcat更重要！；（1）SS浓度越大抑制作用也越大呈一级反应；（2）最
14、适用pH与底物的一致；（3）SS过量时，酶量越多抑制作用越强；（4）SS本身无抑制活性，生成的Is是一种亲和标记的抑制剂；（5）必需基团与Is化学计量关系是1：1；（6）真正的底物能竞争性阻断Ss的抑制作用。,例,-羟基癸酰硫酯脱水酶；催化羟基癸酰硫酯脱水并催化产生的,顺式和，反式双键两种化合物转变；3，4-癸炔酰-N-乙酰半胱胺为其不可逆抑制剂，其炔基可转化为具有连丙二烯结构化合物，此化合物可烷化活性中心有关基团；与黄素有关的单胺氧化酶和以哆醛为辅基的酶都能被有关炔类化合物以这种方式不可逆抑制。,H,医学应用,酶不但可作出了为治疗手段，同时也可作为靶子使致病菌或异常细胞中某些酶被特定化合物抑
15、制失活，从而使病菌或异常细胞死亡；酶失活剂对人体有毒，而自杀底物与酶天然底物一样对人体无毒，故有极高医学价值！1，迫降灵是线粒体上单胺氧化酶自杀底物，肠道吸收的代谢产物酪胺在酶被“杀死”后进入血液循环成为假神经递质，导致血压下降；2，癫痫病的治疗人脑中氨基丁酸转氨酶破坏脑中抑制性神经递质氨基丁酸,导致癫痫病发作;乙烯代氨基丁酸可杀死该酶;此酶被杀死后,氨基丁酸量增高,脑中枢受抑,从而治疗了此病.,二、可逆抑制作用,可逆抑制剂与酶结合后产生的抑制过程可依米氏学说加以推导,定出其定量关系;可逆抑制的动力学关系由抑制剂与酶的解离常数Ki和抑制剂的浓度决定。,一些重要的可逆抑制剂,最重要的是竞争性抑制
16、剂。如：磺胺药、TMP、氨基叶酸等。用增加底物浓度的方法可以减弱抑制作用。 磺胺药物的作用机制：,根椐抑制剂与酶结合的情况，可逆抑制分为以下几种类型,竞争性抑制（link)非竞争性抑制(link) 反竞争性抑制(link)线性混合抑制(link)底物抑制(link)附：产物抑制(link)附：激活剂(link),(go),( 一)、竞争性抑制作用(competitive inhibition),某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。指抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥。特征：1，结构与正常底物相似；2，不形成EIS三联复合物；3，一旦形成EI后，由于I缺少具反应活性的基团或位置不当，形成死端复合物（dead-end complex）,
