《mPEG修饰红细胞Rh抗原稳定性的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《mPEG修饰红细胞Rh抗原稳定性的研究（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1mPEG 修饰红细胞 Rh 抗原稳定性的研究作者：邱艳，查，檀英霞，章扬培【摘要 】 本研究旨在探究 mPEG 修饰的红细胞 Rh 抗原的稳定性。利用红细胞膜蛋白 SDS-PAGE 电泳技术分析 mPEG 修饰后红细胞膜蛋白与 mPEG 结合情况，用红细胞血影凝集实验及 4 CPD保养液保存的修饰红细胞与匹配血液体外混血实验，观察 mPEG 修饰后红细胞 Rh 抗原被遮蔽的稳定性。结果发现：不同保存时间的mPEG 修饰的红细胞在模拟输血（即混血前后）的血型保持不变，同时 mPEG 修饰的红细胞在保存过程中游离血红蛋白水平正常，并且混血后经 37孵育的 mPEG 修饰的红细胞游离血红蛋白水平低
2、于不混合的修饰的红细胞。比较分析 PEG 特异的碘染和考马斯亮蓝染的显色图谱发现，特殊的碘染显示出 mPEG 与红细胞膜蛋白结合的条带，mPEG-SPA 与红细胞膜蛋白结合后导致蛋白分子迁移速度发生改变。mPEG 修饰的红细胞血影凝集实验证实，修饰红细胞在质膜裂损后 mPEG 仍有效地遮蔽抗原。结论： mPEG-SPA 不论在红细胞膜蛋白被单独提取后，还是膜破损后以及存活状态下，均能与红细胞膜蛋白稳固结合。 【关键词】 mPEG 修饰红细胞；Rh 抗原；红细胞2Rh Antigen Stability of mPEG Modified Red Blood CellsAbstractThe ob
3、jective of study was to investigate the Rh antigen stability of mPEG-modified RBC. RBC membrane protein SDS-PAGE technology was used to analyze the combination of the mPEG modified RBC membrane protein with mPEG molecules; the RBC ghost coagulation test and 4 CPD-preserved modified RBC mixed with ma
4、tched blood were used to observe the stability of RBC Rh antigen camouflaged by mPEG. The results showed that the blood groups of stored mPEG-modified RBC were kept consistency before or after simulating transfusion, i.e. mixture of modified RBC with matched bloods, while the plasma hemoglobin after
5、 simulating transfusion was not only within the normal range during the storage, but also less than that before simulating transfusion even after incubation at 37. The electrophoresis pattern stained with iodine and Coomassie blue displayed the bands of mPEG combined with RBC memberane protein and t
6、he slow mobility of membrane protein. The hemagglutination of PEGylation RBC ghosts did not take place and mPEG still covered the antigen. In conclusion, 3mPEG-SPA can bind the erythrocyte with its extracted membrane protein in both ghosts and living erythrocytes.Key words mPEG modified red blood ce
7、ll; Rh antigen; red blood cellmPEG-SPA 可以与蛋白质和多肽中的赖氨酸（K） 、精氨酸(R)的胺基、组氨酸(H) 的咪唑基以及酪氨酸 (Y)的羟基发生化学反应，形成共价结合键，从而结合到蛋白质多肽上1 ，达到遮蔽抗原的作用。mPEG 与红细胞膜 Rh 抗原结合后是否稳定，进入人体后是否会脱落，这些问题关系到修饰后红细胞进入人体后的安全性。为此，我们采用 mPEG 修饰的红细胞膜蛋白 SDS-PAGE 电泳、红细胞血影凝集实验以及用 4 CPD 保养液保存的修饰红细胞与匹配血液进行的体外混血实验，对 mPEG 修饰后红细胞 Rh 抗原被遮蔽的稳定性进行了初步的
8、研究。材料和方法样品20 mmol/L mPEG-SPA 修饰的 AB、RhDEeCc 红细胞，AB、 RhD-全血，RhD+血液血浆。4试剂CPD 保养液、低渗磷酸缓冲液（20 mOSM，pH 7.4） 、 10 mmol/L Tris-盐酸低渗缓冲液、等渗液、电泳缓冲液、30%聚丙烯酰胺凝胶溶液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%分离胶、10%基层胶、0.25%考马斯亮蓝 R-250、脱色液、样品处理液、蛋白分子量标准物（marker） 。仪器倒置显微镜、KUBOTA2100 离心机（ Japan） 、EBA12R Zentrifugen 低温高速离心机（Beckman 公司产品，Germ
9、any ） 、XMTB 数显调节仪水浴锅（浙江余姚工业仪表二厂产品） 、Mini-Protean 型电泳仪（Bio-Rad 公司产品， USA） 、TS-1 型脱色摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司产品） 。mPEG 修饰红细胞体外稳定性检测将 CPD 保存的血比容为 35%的 20 mmol/L mPEG-SPA 修饰的 ABRhDEeCc 红细胞、 ABRhD-全血、RhD+血浆分装，于 2-6保存并在储存第 1、7、14、21 天时取 CPD 保存的修饰的5ABRhDEeCc 红细胞 50 l，用间接抗人球蛋白试验鉴定血型后，分别加入 250 l 的 ABRhD-全血和 RhD+血浆
10、，以 CPD 保存的血比容为 35%的 20 mmol/L mPEG-SPA 修饰的 ABRhDEeCc 红细胞RhD-全血和 RhD+血浆作为对照，在 37摇动孵育 24 小时后，再次检测血型和血浆游离血红蛋白。mPEG 修饰的红细胞血影凝集实验取未修饰和修饰的红细胞各 40 l，加 10 倍体积的PBS（pH 7.4） ，4放置 30 分钟， 3500g/min 离心 10 分钟，弃上清，加入 600l 的低渗磷酸缓冲液，4放置 30 分钟， 3500g/min 离心 10 分钟，弃上清，低渗磷酸缓冲液洗涤 4 次， 3500g/min 离心 10 分钟，沉淀即为血影细胞。在血影细胞加入R
11、h anti-D 多抗后，在倒置显微镜下观察结果。mPEG 修饰的红细胞膜蛋白的 SDS-PAGE 分析红细胞膜蛋白的提取取 CPD 抗凝血 100 l，以2000g/min 10离心 5 分钟，除去血浆和灰白色血细胞层；另取mPEG-SPA 修饰红细胞约 40 l，加预冷的等渗液将沉淀 RBC 悬浮，以 2000g/min 10离心 5 分钟，除去上清液，如此重复洗涤 3遍；按 110（v/v）向沉淀 RBC 中加入预冷的低渗液，混匀后 46放置至红细胞完全溶血；以 1000g/min， 4离心 10 分钟，除去上清液，将沉淀在 4 用低渗液 6000g/min 离心 5 分钟，洗涤3 次，
12、获得白色的 RBC 膜样品。电泳分别配制 10%分离胶和基层胶，灌分离胶，37 放置40 分钟，待胶凝固，灌基层胶，放梳子组装电泳装置；将蛋白marker 及取得的 RBC 膜样品各 10 l 与 5样品缓冲液在Eppendorf 管中混合；95加热 5 分钟，将蛋白变性；用微量加样枪将样品加入样品孔底部；180 V 恒压电泳至溴酚蓝指示剂移动至电泳胶外。PEG 碘染色2将电泳后的胶放入容器内，在摇床上缓慢振荡的过程中加入 20 ml 0.1 mol/L 的高氯酸，15 分钟后依次加入5 ml 5%氯化钡，2 ml 0.1 mol/L 碘溶液。5 分钟后见到碘染的PEG 条带逐渐出现，拍照、记
13、录结果。考马斯亮蓝染色将碘染的胶放在蒸馏水中漂洗约 20 分钟，碘染条带逐渐消失；将约 20 ml 考马斯亮蓝染液放入盛胶的容器里，摇床缓慢振荡约 2 小时，将染液弃去，再在水中漂洗数次，然后加入脱色液，脱色的条带清晰，背景变浅，其中更换脱色液数次，拍照、记录结果。7统计学处理采用 SPSS 10.0 软件对检测结果进行 Chi-square 检验。结果mPEG 修饰红细胞体外稳定性修饰的 ABRhDEeCc 红细胞在储存过程中和模拟输血过程（即与全血和血浆混合后于 37孵育 24 小时）, Rh 血型D、E、e、Ch 和 c 抗原未发生变化，mPEG 修饰红细胞在保存过程中血浆游离血红蛋白水
14、平正常，修饰的 ABRhDEeCc 红细胞在模拟输血过程后，游离血红蛋白未见升高，反而降低，且 1 组和 6 组在统计学有显著差异，1 组和 7 组在统计学同样有显著差异（附表） 。Table. Plasma free hemoglobin change in the process of blood mixture（略）mPEG 修饰的红细胞血影凝集mPEG-SPA 修饰前后的红细胞处理得到的血影和 IgGM RhD 多克隆抗体，用直接凝集实验进行鉴定，结果表明 mPEG 修饰前的红细胞发生了凝集，而 mPEG-SPA 修饰后的红细胞未发生凝集（图 1） 。8mPEG 修饰的红细胞膜蛋白的
15、SDS-PAGE 电泳分析红细胞膜蛋白经 SDS-PAGE 碘和钡染色后， 未修饰红细胞膜蛋白和蛋白 marker 均未出现， 只有 2.0 mmol/L mPEG-SPA 修饰的红细胞膜蛋白出现条带，主要是血影蛋白、条带 3，条带 4.1 和 4.2 及血型糖蛋白（图 2） ；红细胞膜蛋白经 SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色后，蛋白 marker、2.0 mmol/L mPEG-SPA 修饰的、未修饰的红细胞膜蛋白均出现条带；未修饰的红细胞膜条带 3、条带 4.1、条带 4.2、肌动蛋白和血型糖蛋白条带的迁移速度均快于修饰的红细胞膜蛋白条带（图 3） 。讨论mPEG 与红细胞膜只有稳定结合，
16、才能保证其输入人体后不脱落，被修饰的抗原不会暴露，因而不会导致机体产生免疫应答反应。在对重组蛋白、酶、药物等的应用和研究基础上发现，PEG 与蛋白分子共价结合后会进一步吸附水分子，使蛋白分子具有一个PEG 和水分子包裹亲水外壳，这个外壳能有效地遮蔽蛋白质表面的抗原3 。已有研究结果显示， Rh 血型抗原膜外的1、2 、3 、 4、5 环上均存在与 mPEG-SPA 发生反应的氨基酸 K 、R 、H 和 Y，后者是 mPEG 共价结合蛋白质氨基酸物质基础。因9此，从理论上讲结合应是稳定的。由于目前缺乏成熟的修饰红细胞动物评价模型4 ，因此我们设计了 mPEG 修饰红细胞体外稳定性实验，结果表明：不同保存时间的 mPEG 修饰的红细胞在模拟输血即混血前后的血型保持不变，这一结果不仅支持修饰的红细胞血型在体外不变，而且也提示其进入体内应是稳定的；同时 mPEG 修饰的红细胞在保存过程中游离血红蛋白水平正常，并且
