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1、1KOH 涂片镜检法诊断真菌性角膜炎的意义作者:杨莉萍,黄文明,樊翌明,李瑞庄 【关键词】 KOH 涂片 【摘要】目的:探讨 KOH 涂片镜检法对真菌性角膜炎的诊断意义,了解湛江地区真菌性角膜炎的病原学。方法:取 102 例真菌性角膜炎患者的角膜溃疡标本,作 KOH 涂片镜检、真菌培养及菌种鉴定。结果:KOH 涂片镜检法和真菌培养法的阳性率分别为97.1(99/102) 、94.9(93/98) ,二者的真菌检出率差异无显著性(P0.05) 。93 份培养阳性标本中,共分离出 18 属 33 种真菌,其中镰刀菌属、弯孢霉属和曲霉属真菌分别占36.6%、27.9%、7.5%。结论:KOH 涂片镜
2、检法是早期诊断本病的简单、有效方法。镰刀菌和弯孢霉是湛江地区真菌性角膜炎的主要致病菌。 【关键词】角膜炎;真菌;培养 【Abstract】 Objective: To investigate the diagnostic value of potassium hydroxide based smear assay for mycotic keratitis and the pathogenic spectrum in Zhanjiang area. Methods: The corneal scrapings from 102 patients with fungal keratitis we
3、re subjected to 10% KOH based smear before microscopic observation, fungal culture and strain 2identification. Results: The positive rates of fungal infection of fungal keratitis detected by KOH based smear and fungal culture were 97.1% (99/102) and 94.9% (93/98), respectively, and there was no sign
4、ificant difference in the fungal detection efficiency between the two methods (P0.05). The pathogenic fungi belonged to 18 genus and 33 species; of which, Fusarium, Curvularia and Aspergillus accounted for 36.6%, 27.9% and 7.5%, respectively. Conclusion: The KOH based smear is simple and effective i
5、n the early diagnosis of fungal keratitis. Fusarium and Curvularia are the predominant pathogens of mycotic keratitis in Zhanjiang district. 【Key words】 keratitis; fungus; culture 真菌性角膜炎的患病率在我国呈逐年上升趋势,其致病菌迄今已多达 70 种1 。真菌性角膜炎的处置不当将导致角膜穿孔、失明甚至眼球摘除,而治疗的成功和视力的恢复取决于早期、快速、正确的诊断。虽然 KOH 涂片镜检法目前仍是发展中国家快速诊断真菌
6、性角膜炎的主要检测方法,但国内有关其对本病的诊断意义的报道少见26 。本文分析了我院 2003 年 10 月2005 年 12 月间诊治的 102 例真菌性角膜炎的真菌学检查结果,旨在了解 KOH 涂片镜检法对真菌性角膜炎的诊断意义。 1 资料与方法 1.1 病例资料 3102 例患者中,男 71 例,女 31 例,年龄 685 岁(平均 48.7岁) ,病程 360 d(平均 13.9d) ;均为单眼患病,其中右眼 55 例,左眼 47 例;农民 89 例,工人 9 例,学生 4 例。58 例有明确的眼外伤史,引起外伤的异物为谷粒或谷尘(20 例) 、可疑尘埃(20 例)、泥土(5 例) 、
7、木屑( 4 例) 、甘蔗叶(3 例) 、焊屑(2 例) 、水泥粉(1 例) 、竹片(1 例) 、橘叶(1 例) 、草刺伤(1 例) 。 1.2 标本采集 1%的卡因行患眼表面麻醉,2 min 后在无菌操作下用手术刀刮取角膜溃疡组织,置于含少量灭菌生理盐水的无菌离心管中送检。 1.3 KOH 涂片镜检 用无菌白金耳挑取适量送检的角膜溃疡组织置于载玻片上,涂片时尽量将角膜组织薄层铺开,加 1 滴 10% KOH 液,盖上盖玻片,显微镜下查找真菌。 1.4 真菌培养 将余下的角膜溃疡组织接种于 2 支沙氏培养基(SDA)试管斜面上,27 培养 2 3 周,观察有无真菌生长。 1.5 菌种鉴定 2 支
8、 SDA 试管中均有真菌生长,且菌落形态一致者,初步确定其为致病菌。取其菌落移种于葡萄糖马铃薯琼脂(PDA)或察氏培养基平皿上,27 培养 2 周,观察其生长形态及速度;同时将菌落移种于 PDA 或察氏培养基行微量培养,每天镜下观察真菌菌丝和分生孢子生长情况。根据菌落颜色、形态、生长速度及有无液体渗出,4以及菌落涂片和微量培养镜下菌丝颜色、形态和分生孢子的形态、结构及产孢方式等特点,进行菌种鉴定78 。 1.6 统计学处理 采用配对卡方检验。 2 结果 102 份角膜溃疡标本中均检出真菌,其中 4 份因缺乏标本而未作真菌培养。KOH 涂片镜检 102 份,其中阳性 99 份(97.1) ,阴性
9、 3 份(2.9) ;真菌培养 98 份,其中阳性 93 份(94.9) ,阴性 5 份(5.1) (表 1) 。在 KOH 涂片镜检阴性的 3 份标本中,真菌培养分离出面包串珠霉菌、顶套菌和丛生菌各 1 例。真菌一般在34 d 内开始生长,但培养基需要保存 46 周。93 份培养阳性标本中,共分离出 18 属 33 种真菌,其中以镰刀菌属、弯孢霉属和曲霉属真菌多见(表 2) 。表 1 98 份角膜溃疡标本中 KOH 涂片镜检法与真菌培养法结果的比较表 2 93 例真菌性角膜炎的致病真菌分类 3 讨论 虽然临床表现有助于真菌性角膜炎的诊断,但明确诊断依赖于实验室检查,如角膜刮片或活检标本直接镜
10、检、染色检查、组织病理检查、真菌培养、共焦显微镜和 PCR 技术23 。尽管真菌直接镜检不能鉴别感染的菌种,但其是快速诊断真菌性角膜炎的重要方法。以真菌培养为标准,KOH 涂片镜检法对真菌性角膜炎的敏感度为72.291,Gram 染色为 31.698.0 ,Giemsa 染色为27.085.0,calcofluor white (CFW )染色为580.090.0,PAS 染色为 91.0,六胺盐染色为56.089.0,乳酚棉蓝(lactophenol cotton blue)染色为70.080.0,吖啶橙染色为 65.023 。共焦显微镜检查和PCR 技术尽管在本病的诊断中已显示出良好的应用
11、前景,但还有许多问题需进一步研究。 KOH 涂片镜检法诊断真菌性角膜炎的敏感性为 81.2,特异性为 83.84 ;其与真菌培养法结果的阳性一致率为82.090.05 。本文结果显示 KOH 涂片镜检法对真菌的检出率高达 97.1,其与真菌培养法的检出率差异无显著性。因此,KOH 涂片镜检法具有简单、快捷、价廉、结果可靠的优点,可作为早期诊断真菌性角膜炎的主要方法。高倍镜下见到无色透明的菌丝可初步考虑为丝状真菌感染,而见到无色、折光性强、大小不一的孢子则考虑为酵母菌感染。由于真菌具有向角膜组织内生长的特性,故在取材时要先擦除表面的坏死组织,再用刀片反复刮取角膜溃疡底部和边缘组织。另外,在涂片时
12、要尽量将角膜组织薄层铺开,这样可更清晰地显示真菌菌丝和孢子。 由于真菌培养可提高病原体的检出率、鉴定菌种和进行药敏试验,故其目前仍是诊断真菌感染的“金标准” 23,5 。虽然改良 SDA培养基足以分离出各种不同的眼部真菌,但最好联合应用固体和液体培养基分别在 37、2530环境下进行培养2 。Rosa等9用改良 SDA 培养基进行真菌性角膜炎患者的角膜刮片培养,发现培养阳性率为 90,2 d、3 d 和 1 周内的阳性率分别为654.0、83.0、97.0。病例的选择是影响真菌培养阳性率的主要因素,如化脓性角膜炎的阳性率为 20.050.0,真菌性角膜炎为 50.080.05 ,本文则高达 9
13、4.9。在本组病例中,有3 例患者作直接镜检阴性,但真菌培养阳性。因此,对于可疑的真菌性角膜炎患者,均需同时作 KOH 涂片镜检和真菌培养与鉴定,有条件者还应作药敏试验,从而避免漏诊和指导治疗。 虽然真菌性角膜炎的致病菌存在明显的地域性差异,但其种类在过去的 20a 中并未发生明显的变化 3 。丝状真菌和暗色真菌(弯孢霉属、离蠕孢属)是其主要致病菌,而酵母和酵母样真菌较少见2 。Gopinathan 等6 总结了印度南部 1352 例真菌性角膜炎患者的实验室检查结果,发现镰刀菌属、曲霉属和弯孢霉属分别占37.2、30.7、2.8 。国内调查显示:华北地区和郑州地区真菌性角膜炎的致病菌属相同,依
14、次为镰刀菌属、曲霉属和青霉属;华南地区在 19751986 年期间的主要致病菌依次为曲霉属、镰刀菌属和青霉属,而 19891997 年期间则变为镰刀菌属、曲霉属和弯孢霉属10 。本组病例的主要致病菌依次为镰刀菌属、弯孢霉属和曲霉属,镰刀菌属中以茄病镰刀菌最多见。虽然湛江地区在地理位置上与广州较接近,但本文所见的弯孢霉属明显多于宋书华等5的报道,而曲霉菌属较少见。 参考文献: 1 王丽娅,孙声桃,张月琴,等. 河南地区真菌性角膜病致病菌种调查J. 中国实用眼科杂志,2003,21(3):224225. 7 2 THOMAS P A. Current perspectives on ophthal
15、mic mycoses J . Clin Microbiol Rev, 2003, 16(4): 730797. 3 SRINIVASAN M. Fungal keratitis J. Curr Opin Ophthalmol, 2004, 15(4): 321327. 4 SHARMA S, SILVERBERG M, MEHTA P, et al. Early diagnosis of mycotic keratitis: predictive value of potassium hydroxide preparation J . Indian J Ophthalmol, 1998, 4
16、6(1): 3135. 5 宋书华,林跃生,黎明,等. 真菌性角膜炎的病原学分析J. 中国实用眼科杂志,2005,23(5):506508. 6 GOPINATHAN U, GARG P, FERNANDES M, et al. The epidemiological features and laboratory results of fungal keratitis: a 10year review at a referral eye care center in South India J . Cornea, 2002, 21(6): 555559. 7 孙鹤龄. 医学真菌鉴定初稿 M. 北京: 科学出版社, 1987. 8 叶世泰, 乔秉善,