《Knockout血清替代品可提高C57BL-6J小鼠胚胎干细胞建系效率》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Knockout血清替代品可提高C57BL-6J小鼠胚胎干细胞建系效率（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1Knockout 血清替代品可提高 C57BL/6J 小鼠胚胎干细胞建系效率作者：王宏, 田海滨, 陈娟, 沙红英, 陈建泉 , 成国祥【关键词】 knockout 血清替代品;,C57BL/6J 小鼠;,胚胎干细胞;,建系效率Knockout serum replacement improves establishment efficiency of C57BL/6J mouse embryonic stem cell lineAbstract AIM: To eliminate the influence of serum on selfrenewal of embryonic stem
2、 cells (ESCs), knockout serum replacement (KSR), a defined formulation, was used to replace serum for the establishment of C57BL/6J mouse ESC line. METHODS: C57BL/6J mouse blastocysts collected at 3.5 days post coitum (d.p.c.) were cultured in the medium supplemented with KSR. In control experiment,
3、 KSR was substituted by fetal bovine serum (FBS). When ESC line was established, the morphology of ESCs, the expression of alkaline phosphatase and oct4, and the karyotype and differentiating ability of ESCs were analyzed. RESULTS: 13 2blastocysts were cultured in the medium supplemented with KSR an
4、d one ESC line (MES1) was established with a normal and stable XX karyotype after cultured for more than 20 passages, and then the high expression of alkaline phosphatase and oct4 was detected. When cultured in suspension, MES1 formed embryoid bodies. When inoculated subcutaneously into nude mice, M
5、ES1 formed teratoma. After injected into ICR mouse blastocysts collected at 35 d.p.c., MES1 incorporated into the inner cell mass of the host blastocyst and contributed to the development of a chimera. In control experiment, no ESC lines were cultured for more than 3 passages. CONCLUSION: KSR can be
6、 efficiently used to isolate and culture C57BL/6J mouse ESCs, which can eliminate traditional prescreening of FBS suitable for isolation and culture of ESCs. Keywordsknockout serum replacement; C57BL/6J mouse; embryonic stem cells; establishment efficiency摘 要 目的 : 在培养液中添加 knockout 血清替代品(knockout ser
7、um replacement, KSR)代替胎牛血清(FBS)用于建立C57BL/6J 小鼠胚胎干细胞（ESC）细胞系 , 以便消除血清中的不确3定因子对 ESC 增殖的影响。方法: 以 C57BL/6J 小鼠 3.5 d 的囊胚为材料分离 ESC, 比较 KSR 和 FBS 用于建立小鼠 ESC 细胞系的效率, 并通过体内、 外分化验证所分离获得的小鼠 ESC 的发育潜能。结果: 培养液中添加 KSR, 成功从 13 个小鼠囊胚中分离获得一个ESC 细胞系(MES1), 体外培养传代超过 20 代仍保持未分化状态, 核型为正常 XX 型,碱性磷酸酶及 oct4 基因高表达, 悬浮培养可以生成
8、拟胚体, 接种到裸鼠皮下可形成畸胎瘤, 注射到 ICR 小鼠 3.5 d 囊胚中, ESC 可以参与胚胎发育并产生嵌合体小鼠。而培养液中添加 FBS的对照组未能获得超过 3 代的 ESC 细胞系。结论: 在培养液中添加KSR 代替 FBS 适合于 C57BL/6J 小鼠 ESC 的分离与培养, 从而可避免实验前对所用血清的筛选。关键词knockout 血清替代品; C57BL/6J 小鼠; 胚胎干细胞; 建系效率小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)细胞系最早是在 1981 年由 Evans 和 Kaufman 以小鼠囊胚为材料 , 体外培养分离获得。近年来, 由
9、于小鼠 ESC 具有胚胎嵌合和生殖系嵌合能力1 以及在特定条件下可定向分化2, 3等的特性, 因此在早期胚胎发育研究4、 基因打靶技术的改进5 和利用细胞移植进行疾病的治疗6等研究领域得到了广泛的应用。然而影响小鼠 ESC 分离培养的因素很多, 很关键的一点是血清的质量7。实验室一般是先筛选出适合4ESC 生长的血清, 大量购置, 冻存备用, 这必然使实验操作较为繁琐。Knockout 血清替代品(knockout serum replacement, KSR)是一种人工合成产品, 成份明确, 质量易于控制,因而应用该血清替代品将可避免实验前对血清的筛选。本研究中成功地以 KSR 替代胎牛血清
10、(FBS)从 C57BL/6J 小鼠 35 d 囊胚分离获得 ESC, 并可长期传代。分离获得的 ESC 发育多能性通过体内外分化以及嵌合体小鼠的制备得到验证。而采用 FBS 的对照组未能获得超过 3 代的 ESC 细胞系。从而证实 KSR 适合于 C57BL/6J 小鼠 ESC 的分离与培养。1 材料和方法1.1 材料 细胞培养液 DMEM, knockout DMEM, 细胞培养用 PBS、 谷氨酰胺、 胰蛋白酶/EDTA 、 青霉素、 链霉素、 秋水仙素、 非必需氨基酸、 FBS、 KSR 以及 Trizol 试剂, 均为 Gibco公司产品。明胶、 2 巯基乙醇、 低熔点琼脂糖、 重组
11、鼠白血病抑制因子（LIF） 、 重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） 、 底物DAB、 碱性磷酸酶染色试剂盒、 Giemsa 染色液均为 Sigma 公司产品。丝裂霉素 C 为 CalBiochem 公司产品。反转录试剂盒购于Promega 公司。抗体均购于 Neomarkers 公司。引物由宝生物工程有限公司合成。实验中 C57BL/6J 小鼠、 ICR 小鼠、 裸鼠均购自上海实验动物中心。51.2 方法1.2.1 饲养层的制备 取 135 d 的 ICR 小鼠胚胎, 按常规方法制备原代小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblasts, MEF), 培养液为 DMEM
12、, 内含 2 mmol/L 谷氨酰胺、 100 mL/L FBS、 100 U/mL 青霉素、 100 g/mL 链霉素。待细胞长满后, 在培养液中加入终浓度 10 mg/L 的丝裂霉素 C, 处理 2、 3 h。经 PBS 清洗5 次, 用 2.5 g/L 胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA 消化, 按1105/cm2 密度将细胞接种到预先涂有 1 g/L 明胶的 4 孔板中备用, 用前更换培养液。1.2.2 ESC 细胞系的建立 收集 35 d 的 C57BL/6J 小鼠囊胚培养在制好的饲养层上, 培养液为 Knockout DMEM, 内含 150 mL/L KSR、 2 mmo
13、l/L 谷氨酰胺、 0.1 mmol/L 非必需氨基酸、 0.1 mmol/L 2 巯基乙醇、 100 U/mL 青霉素、 100 g/mL 链霉素、 1000 U/mL LIF 和 10 ng/mL bFGF, 置 37、 50 mL/L CO2 培养箱中培养。4、 5 d 后, 内细胞团（inner cell mass, ICM）细胞增殖旺盛, 此时将 ICM 离散成小的细胞团块, 接种到预先制好的饲养层上。58 d 后, 出现的 ESC 集落可供建立 ESC 细胞系。以后每2、 3 d 传代 1 次。对照组中培养液内用 150 mL/L FBS 替代KSR。61.3 碱性磷酸酶活性检测
14、取指数生长期 ESC, 用碱性磷酸酶染色试剂盒对 ESC 集落染色。1.4 核型分析 用玻璃针挑取 ESC 集落, 经 2.5 g/L 胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA 消化成单个细胞后, 接种到 1 g/L 明胶包被的培养皿内, 待细胞丰度达 80%时, 用 0.4 g/mL 秋水仙素处理 3 h, 常规空气干燥法制片, 0.25 g/L 胰蛋白酶消化 26 min, Giemsa 染色。1.5 Oct4 基因的表达检测 用 Trizol 试剂法从 106 个 ESC 中提取总 RNA, 反转录试剂盒反转录得 cDNA 第 1 链。经 PCR 扩增, 琼脂糖凝胶电泳分析 oct4
15、基因的表达。引物为: 5GGCTGGACACCTGG CTTC 和 5GCTCCAGGTTCTCTTGTCTAC, PCR 条件为: 95 4 min; 94 30 s, 58 30 s, 72 1 min, 30 循环; 72 10 min。1.6 ESC 体外分化 取处于指数生长期的 ESC 集落, 用 25 g/L 胰蛋白酶/053 mmol/L EDTA 消化, 轻轻吹打成小的细胞团块, 离心去掉消化液。用不添加 LIF 和 bFGF 的 ESC 培养液按 1109/L密度重悬细胞, 转移到铺有 10 g/L 低熔点琼脂糖的培养皿内 , 4 d 后, 有拟胚体（embryonic bo
16、dies, EB）出现。将 EB 接种到铺有明胶的培养皿内培养, 7 d 后进行常规免疫组织化学染色 , 一抗为抗肌肉7特异性肌动蛋白(小鼠 IgG, 1100), 二抗为 HRP 标记的兔抗鼠 IgG (1100), 底物为 DAB。阴性对照组以 001 mol/L PBS 代替一抗。1.7 ESC 体内分化 将 1106 个 ESC 接种到裸鼠皮下, 2 周后即可观察到畸胎瘤的出现, 5 周后手术取畸胎瘤按常规方法制成石蜡切片, 经苏木精、 伊红染色后镜检。1.8 嵌合体小鼠的制作 将指数生长期的 ESC 集落消化成单个细胞, 去掉饲养层细胞后, 用显微注射的方法将 ESC 注射到 35 d的 ICR 小鼠囊胚腔中 , 13 h 后, 移入假孕 ICR 母鼠子宫, 观察出生后的小鼠, 判断有无毛色嵌合。2 结果2.1 小鼠 ESC 分离与培养 手术获得 33 个 35 d 的C57BL/6J 小
