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1、1KH902 抑制猴激光致脉络膜新生血管 摘要 目的 血管内皮细胞生长因子（ VEGF）在视网膜新生血管发生中起着核心而关键的作用。有证据表明，VEGF 在老年黄斑变性（AMD）的脉络膜新生血管发生中也是一个重要的刺激因子。复明肽（KH902）是成都康弘生物科技有限公司提供的人源化的抗体样 VEGF 捕获蛋白，与 VEGF 有着较高亲和力，因此被认为能够抑制新生血管的形成。本研究的目的在于观察通过玻璃体腔注射KH902，是否能够有效抑制激光致恒河猴脉络膜新生血管的产生和生成。方法 采用 VISULAS532S 固体激光器以 240 mW，50 ms进行激光眼底照射恒河猴双眼 Bruch 膜和覆
2、盖其眼上的视网膜色素上皮，击穿 Bruch 膜，每眼烧出 59 个直径约 50 m 损伤点。然后经玻璃体内注射复明肽（640 g/眼； n=4 眼/组）或等体积PBS，每周注射 1 次。3 周后行眼底血管荧光造影，观察并记录激光斑荧光渗漏情况并采用 SPSS10.0 软件进行统计学分析。结果 在注射 PBS 的对照组，有 48%（12/25 ，4 眼）的激光损伤斑出现强荧光渗漏，而复明肽给药组，仅有 8%（2/24，4 眼）的激光损伤斑发现有荧光渗漏，且有渗漏非常轻微，未发现强荧光渗漏，两组差异具有显著性（P0.05） 。结论 该研究显示，复明肽（KH902）具有强烈抑制激光致恒河猴脉络膜新生
3、血管的作用，提示其在治疗新生血管性 AMD 的方面具有很好的临床应用前景。2关键词 复明肽；脉络膜新生血管；血管内皮细胞生长因子Fumintide suppresses choroidal neovascularization in laser injury cynomolgus monkeys Abstract Objective Vascular endothelial growth factor (VEGF) plays a central role in the development of retinal neovascularization and diabetic macular
4、 edema. There is also evidence suggesting that VEGF is an important stimulator for choroidal neovascularization in aged macular degeneration (AMD). Fumintide (Kanghong Co. Chengdu， P. R. China) is a humanized antibodyliked molecule designed to bind VEGF. This protein was suggested to supress the neo
5、vascularizations. To study the efficacy of intravitreal injections of fumintide on experimental choroidal neovascularization in the cynomolgus monkey eye. Methods Choroidal neovascularization was induced by laser in jury as 57 ruptures per eye of Bruchs membrane in both eyes of cynomolgus monkeys an
6、d followed with weekly intravitreal injections of fumintide(640 g/eye; n=4/group) or PBS. 3Photography and fluorescein angiography were carried out three weeks later. Fluorescein angiograms were graded using a masked standardized 夏庆杰，男，副研究员，1966 年 7 月出生于山东省聊城市。1997 年 7 月毕业于华西医科大学医学院，医学遗传学专业，方向为医学分子及
7、细胞遗传学，理学博士学位。1995 年起，主要从事精子发生过程中特异表达基因的克隆工作，熟练掌握了现代分子生物学研究技术，并发明了可以体外复制任意 DNA 片段的 UT-PCR 技术，为克隆未知序列的新基因提供了简便有效的方法。1998 年以来获自然科学基金面上课题“脆性 X 综合征快速基因诊断及其新技术探索” ，负责项目设计和组织实施。现已基本完成课题研究工作，发表相关论文两篇并申请相关国家发明专利 3 个。同时还获得四川省计划生育委员会科研课题和华西医大科研课题各 1 项。还作为主研人员参加了国家自然科学重大项目、973 项目、863 项目各 1 项。并于 2000 年当选为成都市青年科技
8、之星。2000 年 3 月以来，主要从事分子生物学新技术探索包括基因表达分析，转基因及基因功能鉴定和基因诊断研究工作，具体为靶基因筛选、引物探针设计、核酸分子杂交动力学及杂交条件优化、芯片杂交新技术、实时荧光定量 PCR 检测技术应用和改进等研究等工作，承担各类科研课题 7 项，发表学术论文 20 余篇。4protocol. The data were analyzed with SPSS10.0. Results In the intravitreal injections of PBS control group， strong fluoroscein leakage was seen i
9、n 48% laser injury spot (12/25，4 eyes)， but in the fumintide treated group， the ratio decreased significantly to 8.3%(2/24，4 eyes)（P0.05). Conclusion This study demonstrates that fumintide has a strong supression on choroidal neovascularization and profiles its clinical use in treating neovascular A
10、MD. Key words Fumintide;choroidal neovascularization;vascular endothelial脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV） ，是指产生于视网膜下脉络膜上的不正常血管，并由于其结构缺陷能渗漏血浆和血液，导致瘢痕组织的生成，从而破坏视网膜功能，尤其是位于黄斑区的新生血管，破坏了中心视力，是导致患者失明的主要原因之一1 。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是刺激形成新生血管的主要因子之一，在5视网膜和脉络膜新生血管发生中起着核
11、心而关键的作用24 。尽管临床上已经开展了激光治疗、手术治疗、放射治疗及药物治疗等多种治疗新生血管的治疗技术，但效果并不理想57 。近年来，抗新生血管药物的研究非常活跃，理论上任何灭活 VEGF 或降低VEGF 作用的药物都具有抑制新生血管形成的作用8，9 。复明肽（Fumintide， KH902）是通过基因工程手段，融合人血管内皮细胞生长因子受体 FLT-1 和 KDR 的特定结构域及人 lgG Fc 片段而形成的重组人源化融合蛋白，能与 VEGF 高亲和力结合，从而阻止VEGF 与其内皮细胞表面的受体结合，阻断其生物活性，理论上能够抑制内皮细胞增殖和新生血管生成。为了探明复明肽是否具有抑
12、制新生血管生成的作用，为该药进一步的临床应用提供动物实验依据，我们采用恒河猴激光致脉络膜新生血管模型，进行了复明肽抑制新生血管作用的实验，现介绍如下。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验药品 玻璃体注射用复明肽，批号：20041001，16 6mg/支，纯度95%，2 8 保存，有效期 2 年。由成都康弘生物科技有限公司提供。配制方法：临用时，从冰箱中取出，自然解冻后使用。1.1.2 实验动物 普通级成年健康恒河猴 4 只，雌雄各半，体重3.05.0 kg，成都平安动物繁育研究基地引进。入室前 1 周接受结核菌素、寄生虫、沙门菌、致贺菌检查，合格后引入。恒河猴饲养于国家成都中药安全性
13、评价中心，普通动物房，实验前动物适应环境并进行驱虫治疗，检测体温，并接受血液学、血清生化、电解质、粪尿液和心电图检查 2 次。选择健康（雌性须未孕）动物作为受试动物，不锈钢猴笼分笼饲养，饲养条件符合国标 GB14925-2001 标准，室温（215），相对湿度（5515）%，12 h 明暗交替。猴用全价营养颗粒饲料喂养，去离子水装瓶自由饮用，每日添加水果。1.2 实验方法71.2.1 动物造模 将 4 只恒河猴，随机分为 PBS 对照组和复明肽实验组 2 组，每组 2 只。3% 戊巴比妥静脉注射麻醉后，美多丽（日本参天制药株式会社）滴眼散瞳，VISULAS 532S 固体激光器以240 mW，
14、 50 ms 进行激光眼底照射 Bruch 膜和覆盖其上的视网膜色素上皮，击穿 Bruch 膜，烧出至少 59 个直径约 50 m 损伤点。1.2.2 给药剂量与方法 通过玻璃体内注射药物，给药剂量及时间（见表 1）为：实验组 2 只，4 眼，共 24 个激光斑，激光照射后当天给予剂量为 640 g/眼，以后每周 1 次；第三组 2 只，4 眼，激光照射后 14 天给予等体积的 PBS 安慰剂/眼，以后每 2 周 1 次。1.2.3 结果判定与统计学分析 观察统计：造模后 20 天做 1 次荧光素血管造影术，计算造影后 10 min 左右时荧光素渗漏产生强荧光斑的数目和范围，以评估脉络膜血管新
15、生的病变情形，并进行统计学分析。表 1 动物分组及给药表表 2 恒河猴激光造模及给药后激光损伤斑部渗漏荧光斑数目 注：实验组与对照组比较，*P0.05，差异具有显著性2 结果8动物在给药期及恢复期间自主活动正常，精神状况良好，皮肤被毛清洁，均未观察到明显异常反应。药效学结果：恒河猴经激光造模、玻璃体内注射药物及眼底荧光造影显示给药组较造模安慰剂组荧光渗漏激光损伤斑数目显著性减少，且在激光损伤斑部荧光渗漏也较给予安慰剂组明显减少，差异具有显著性（见表 2） ，在注射PBS 的对照组，有 48%（12/25 ，4 眼）的激光损伤斑出现强荧光渗漏，而复明肽给药组仅有 8%（2/23，4 眼）的激光损
16、伤斑发现有荧光渗漏，且渗漏非常轻微，未发现强荧光渗漏（见图 1） 。两组差异具有显著性（P0.05） 。见表 2。 3 讨论脉络膜新生血管（CNV）是多种眼底疾病引起视力障碍的重要原因之一，黄斑部位的脉络膜新生血管是一种严重的致盲疾病，是年龄相关性黄斑病变（AMD）的重要病因。由于新生血管的结构缺陷而导致血浆渗漏，使患者视力在短期（几个星期至几个月）内急速下降。我们的恒河猴经激光击穿黄斑区 Bruch 膜，使其产生新生血管的造模，很好地模拟了脉络膜新生血管的产生，有近 1/2 的激9光损伤斑（48%，12/25）发生新生血管和荧光渗漏。在新生血管发生和脉络膜新生血管发生渗漏的过程中，VEGF 起到了关键作用。因为 VEGF 在机体内有两大主要生物学功能：（1）特异地作用于血管内皮细胞，刺激其增殖及移行，诱发新生血管形成；（2）增加血管通透性 3，4 。目前临床上多采用高能激光封闭异常血管的光动力疗法 ，可以
