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1、临床误诊误治2013年12月第26卷第12期Clinical Misdiagnosis&Mistherapy，Vo126，No12，December 2013 93 EGF对食管鳞癌细胞HIFl ot基因表达及功能的影响 潘琦，施瑞华，朱宏，凌亭生，郝波 摘要 目的研究表皮生长因子(EGF)对人食管鳞癌细胞株HIFlot基因表达及功能的影响及其对血管生成拟态相 关基因表达的影响。方法将人食管鳞癌细胞株Eca一109、TEl3分为试验组(加入含EGF 100 gL的无血清DMEM培养 液)和对照组(加入无血清DMEM培养液)，分别于常氧及缺氧下培养。应用蛋白质印迹法(Western blot)检
2、测细胞HIFlot 蛋白与血管内皮钙黏附素(sVEcadhefin)、层黏连蛋白(Laminin53,2)、酪氨酸蛋白激酶受体(EphA2)和基质金属蛋白酶一2 (MMP一2)基因蛋白的表达，应用逆转录聚合酶链反应法(RTPCR)检测HIFlot与sVEcadherin、EphA2和MMP一2 RNA的表 达，基质胶(Matrige1)三维培养显微镜下观察并计数两组细胞的管状结构。结果常氧和缺氧情况下，与对照组比较，试验组 Eca一109、TEl3细胞HIF一1ot蛋白与sVEcadherin、Laminin53,2、EphA2基因蛋白的表达及sVEcadherin、EphA2 RNA水平的表
3、 达均显著增加，差异均有统计学意义(P005)。Eca一109、TEl3细胞均可形成典型的管网状结构，试验组在EGF作用下数目增加，与对照组比较差异有统计 学意义(P005) Compared with the control group，Eca一109 and TEl3 cells could form typical tubuloreticular structure，and the count in EGF group was significantly increased with EGF(P005)Conclusion EGF could upregulate the express
4、ions of HIFl ot，sVEcadherin， EphA2 and RNA in Eca一109 and TEl3 cells under normoxia or under hypoxia conditions，and esophageal sqnamous cancer cell lines Eca一109 and TEl3 are all capable of forming typical tubuloreticular structureEGF can effectively promote their vascularization mim icry formation
5、in vitro Key words Epidermal growth factor；Esophageal neoplasm；Hypoxiainducing factor；Gene expression regulation 早期转移和术后复发是食管癌病死率居高不下的 重要原因。肿瘤内部丰富的微循环网络包括血管生成 拟态(vasculogenic minicry，VM)。 是影响食管癌侵袭 化科 基金项目：国家自然科学基金青年基金(30800511) 作者单位：210029南京，南京医科大学第一附属医院消 通讯作者：施瑞华，Email：ruihuashi126con 转移能力的主要因素，高度侵
6、袭性的食管癌组织中拟 态血管和微血管相互交织，为肿瘤细胞提供了丰富的 血供，并直接影响食管癌患者的预后。而缺氧是机体 普遍存在的过程，可诱导血管生成多种细胞因子的释 放，如缺氧诱导因子一I(HIF一1)。HIF一1是普遍存在于 哺乳动物和人体中的一种转录因子，广泛参与缺氧诱 导的基因表达过程。HIFla与缺氧反应基因的相应结 合位点结合，启动靶基因的转录，促进肿瘤组织的血管 94 f 渔 Q 生 旦箜堑鲞箜 2塑 鲤 !翌 鱼 ：旦! Q I lZ 生成，促进糖酵解过程 ；同时HIF-1与结合位点结 合后抑制细胞的正常凋亡，与肿瘤的生长、发展与转移 过程紧密联系 。在HIFlot调控的信号通路
7、中，最 重要的是PI3KAKT和MAPKERK途径 。 MAPKERK途径主要通过HIFlot磷酸化激活其转录 活性，而PI3KAKT主要调控HIF-lot蛋白水平变化。 表皮生长因子(EGF)在常氧条件下，可通过和相应的 酪氨酸激酶受体结合，激活PI3KAKT信号转导途径 诱导HIF1仅蛋白的表达 。本研究拟通过EGF激活 PI3KAKT信号转导途径诱导食管癌细胞Eca一109、 TEl3的HIF1ot的表达，初步探讨PI3KAKT-HIFlot 信号通路在食管癌VM调控中的作用，为食管癌的防 治探索新的途径。 1材料和方法 11材料人食管鳞癌细胞株Eca一109、TEl3来自中 国科学院上
8、海细胞所；DMEM培养液为Gibco公司产 品；鼠抗人HIFlot单抗为Chemicon公司产品，鼠抗人 13-actin单抗为Sigma公司产品，鼠抗人层黏连蛋白 (Laminin52)单抗为Chemicon公司产品，兔抗人基质 金属蛋白酶一2(MMP-2)单抗为Abcam公司产品，鼠抗 人血管内皮钙黏附素(sVE-cadherin)单抗及鼠抗人酪 氨酸蛋白激酶受体(EphA2)单抗为R&D公司产品； EGF为Sigma公司产品；人工基质Matrigel为BD公司 产品；总RNA抽取试剂Tri-Blue购自上海申能博彩生 物科技有限公司，RNA逆转录试剂盒、聚合酶链反应 (PCR)试剂均为F
9、ermentas公司产品。 12方法 121细胞培养：取对数生长期的Eca-109、TEl3细胞 于不含抗生素且无血清的DMEM培养液饥饿24 h后， 分为常氧对照组、缺氧对照组、常氧试验组、缺氧试验 组，分别进行有氧及缺氧培养。 122蛋白质印迹法(Western blot)检测：应用West eYn blot法检测细胞HIFlot蛋白与sVEcadherin、 Laminin53,2、EphA2和MMP-2基因蛋白的表达。细胞 有氧培养24 h、缺氧培养12 h后弃去培养液，予冷磷酸 盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加蛋白裂解液制备总蛋白， 超声破碎后于4下12 000 rmin离心10 mi
10、n，取上清， 采用BCA法定量蛋白浓度。取总蛋白40 g于100C 加热变性5 min后上样，常温下行稳流(电流40 mA) SDSPAGE电泳，再冰浴下行稳压(电压100 mV)转膜 至PVDF膜，转膜结束后将膜放人5脱脂奶粉中常温 下封闭1 h，用TBST漂洗3次，每次5min，再加入相应 一抗密封后放入4冰箱孵育12 h以上。次13将膜取 出，用TBST摇床漂洗3次，每次5 min，再加入HRP标 记的相对应的二抗(工作浓度羊抗鼠1：5000；羊抗兔 1：5000)，密封后在室温下孵育1 h以上，取出膜，再次 用TBST摇床漂洗3次，每次5 min。最后用ECL化学 发光法曝光、显影，以
11、8actin(工作浓度为1：5000)为 内参照。使用Tanon Gis软件对曝光显影所得的胶片 条带进行灰度值分析，以目的条带与内参照条带Tubu 1in的比值代表目的蛋白的相对表达水平。 行40 mA稳流SDSPAGE电泳，100 mV稳压冰浴 电转至PVDF膜，50 L脱脂奶粉室温封闭1 h后 TBST漂洗3次，每次5 min，加入适当浓度一抗(工作 浓度：鼠抗人HIFlot为1：500，鼠抗人Laminin52单 抗为1：200，兔抗人MMP2单抗为1：2000，鼠抗人 sVEcadherin为1：500，鼠抗人EphA2为1：500)4C 孵育过夜，次日TBST漂洗3次，每次5 mi
12、n，后再加 HRP标记的二抗(工作浓度羊抗鼠为1：5000；羊抗兔 为1：5000)室温孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min， ECL化学发光法显影。 123半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测 HIF1ot RNA表达：细胞有氧培养12 h、缺氧培养6 h后 弃去培养液，PBS洗细胞2次，将常氧和缺氧处理后的 各组细胞用Trizol一步法提取细胞总RNA，按RNA逆 转录试剂盒行逆转录合成cDNA。引物以Primer5软件 自行设计，交由上海申能博彩公司合成。体系为20 Ixl： 10 1 2Tag PCR MasterMix，10 txM HIF一1 ol上、下游引 物各1
13、 txl，10 M GAPDH上、下游引物各05 txl，1 Ixl cDNA，其余用ddH O补足，行HIF1ot及GAPDH双重 PCR反应。程序为：94oC 8 min一(9428 sec一58 28 sec72c【二28 sec)28 eycles-72C 8 min+4。 扩增结束后取PCR产物上样，1琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，Tanon凝胶成像系统摄片并分析结果。 124基质胶(Matrige1)细胞三维培养：取对数生长期 的Eca-109、TEl3细胞，于不含抗生素且无血清的 DMEM培养液饥饿24 h后随机分组，用025胰酶消 化各组细胞至单细胞悬液，取24孑L培养板每孔加人
14、 300 Ixl Matrigel原液，在每孔内接种1 ml浓度为5 10 ml的各组细胞悬液，试验组加入含EGF(100 gL) 的无血清DMEM培养液，对照组加入无血清DMEM培 养液，分别于常氧及缺氧情况下培养6 h、12 h后终止 培养，取出培养皿于倒置显微镜下观察(200)，随机 取5个视野(上、下、左、右、中心)记录并计数管状结构 数量，重复操作3次，取每个视野的均值。 13统计学处理采用SPSS 130统计软件处理数 据。计量资料以均数标准差(xs)表示，采用成组t 检验，以ot=005为检验水准。 2结果 21 Western blot检测结果 常氧情况下，两组Eca 96 临
15、床误诊误治2013年12月第26卷第12期Clinical Misdiagnosis&Mistherapy，Vo126，No12，December 2013 nase FAK)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulation kinase，ERK)、Laminin等均参与了VM形成 的调控 j。缺氧能够诱导VM，作为适应低氧的关键 调节因子，HIF 1ot也是调节肿瘤VM的重要因素。 Leung和Whittaker 发现，HIFlot蛋白在215例食管 鳞癌中表达率达95，HIF一1仅蛋白高表达组血管内皮 生长因子(VEGF)蛋白表达增加，HIF一1仪与VE
16、GF和 微血管密度(MVD)呈正相关。研究发现，食管鳞癌组 织中EGF呈高表达，且EGF的表达与HIF1仅表达呈 正相关，MVD也随之明显增加。 在HIFlot调控的信号通路中，MAPKERK途径 主要通过HIF一1 磷酸化激活其转录活性，而PI3K AKT主要调控HIF1ot蛋白水平变化。EGF可通过和 相应的酪氨酸激酶受体结合，激活PI3KAKT信号转 导途径而诱导HIF1ot蛋白的表达 。本研究常氧和 缺氧情况下，与对照组比较，试验组Eca一109、TEl3细胞 HIFlot蛋白与sVEeadherin、Laminin5,2、EphA2基因 蛋白的表达及sVE-cadherin、EphA2 RNA水平的表达 均显著增加，差异均有统计学意义；而对MMP2基因 蛋白表达及RNA水平均无明显影响，
