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1、在制备型液相色谱中自动生成聚焦梯度曲线使用Agilent 1260 Innity 自动化液质联用纯化系统进行样品纯化技术概述作者Pierre Penduff 与 Andreas Tei 安捷伦科技有限公司 Waldbronn, Germany摘要Agilent 1260 Innity 自动化液质联用纯化系统可使纯化过程实现更高的自动化水平。针对每个目标化合物生成的定制梯度曲线有助于提高分离度、提高色谱柱容量并缩短循环运行时间。安捷伦自动纯化软件可自动化生成不同的定制梯度曲线。本技术概述描述了一种化合物混合物的自动化纯化过程，并展示了不同分析型液相色谱系统与 Agilent 1260 Infin
2、ity 自动化液质联用纯化系统之间的跨平台兼容性。采用四种不同的分析型 (U)HPLC 系统、不同的梯度曲线和不同尺寸的色谱柱对一种混标进行了分析。将得到的四个分析结果文件用于计算梯度曲线并纯化目标化合物。通过使用这种智能软件算法，我们可通过纯化过程获取全部四种化合物的自动化定制梯度曲线。我们对含有 24 mg 目标化合物的 100 mg 样品混合物进行了纯化。纯化后，目标化合物的回收率和纯度分别为 90% 和 99%。2前言Agilent 1260 Infinity 自动化液质联用纯化系统是一种简单易用的智能化解决方案，可在化合物合成后对其进行自动化纯化。该过程从分析方法筛选运行开始，然后进
3、行非线性放大过程，产生的聚焦梯度曲线用于分离特定目标化合物1。采用聚焦梯度曲线的目的是提高： 色谱分离度 进样量 整个流程的效率（通过缩短循环运行 时间）2定义用户权限以简化工作流程安捷伦自动纯化软件通过高度简化的流程，指导不同色谱知识水平的用户成功实现目标化合物的分离。样品提交和软件功能也可根据用户的专业知识水平进行调整。系统提供两种不同的用户模式：一种是适用于经验丰富的色谱工作者的专家 (Expert) 模式，另一种是适用于经验不足用户的简单制备 (Easy-Prep) 模式。选择专家模式后，色谱工作者可创建包含所有纯化过程所需参数的模板文件。所需参数包括系统滞后体积、柱外体积、色谱柱尺寸
4、以及定制聚焦梯度曲线等，这些参数均由经验丰富的色谱工作者创建，用于纯化具有特定色谱行为的不同化合物库。当切换至简单制备模式时，用户可根据需要从一系列预定义模板中进行选择，然后启动纯化过程。表 1 列出了不同的用户权限。图 1. 相同样品两幅色谱图的对比。下图显示将聚焦梯度曲线用于目标化合物（绿色标示）后，分离度更高、运行时间更短1Rs= 2.6Rs= 2.7Rs= 3.2Rs= 3.4IX (min)01521-mFNC12Cr41Rs = 2.6Rs = 2.7Rs = 3.2Rs = 3.4t5 20%IX 6 t5i|i 28%表 1. 两种不同用户模式下的用户权限专家用户简单制备用户新
5、建任务或创建模板任务利用模板进行任务提交更改系统与色谱柱任务特性是否可审查分析数据 如果模板中允许分配不同的目标峰更改梯度曲线 本技术概述描述了一种化合物混合物的自动化纯化过程，并证实了不同分析型 HPLC 仪器与纯化系统之间的跨平台兼容性。采用四种不同的分析型液相色谱系统并通过不同梯度曲线和不同尺寸的色谱柱对一种混标进行了分析。分析结果文件可用于计算定制梯度曲线并纯化目标化合物。实验部分仪器分析型系统 Agilent 1290 Innity 二元液质联用系统 Agilent 1260 Innity 二元液质联用系统 Agilent 1220 Innity 液相色谱系统表 2 列出了 Agil
6、ent 1260 Innity 自动化液质联用纯化系统的各个组件。3色谱柱 Agilent ZORBAX RRHD SB-C18, 2.1 50 mm, 1.8 m (857700-902) Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 50 mm, 1.8 m (827975-902) Agilent ZORBAX SB-C18 快速分离柱, 4.6 100 mm, 3.5 m (861953-902) Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 150 mm, 5 m (883975-902) Agilent ZORBAX Prep HT SB-C18, 21.2 150
7、 mm, 5 m (870150-902)，带有柱端接头 (820400-901)软件 Agilent OpenLAB CDS A.01.05 （ChemStation 版本）及 ChemStation C.01.05 HF05 用于 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版本的 OpenLAB CDS 自动纯化软件 A.01.01 插件溶剂和样品溶剂 A水 + 0.1 % 甲酸溶剂 B乙腈 + 0.1 % 甲酸所有试剂均为液相色谱级，无需脱气。新制超纯水产自配置 0.22 m 膜式终端过滤器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统。用
8、于制备任务的样品混合物咖啡因 (5 mg/mL) 洗脱为色谱峰 1，4-羟基苯甲酸甲酯 (37.5 mg/mL) 为色谱峰 2，4-羟 基苯甲酸乙酯 (37.5 mg/mL) 为色谱峰 3， 4-羟基苯甲酸丙酯 (37.5 mg/mL) 为色谱峰 4， 4-羟基苯甲酸苯甲酯 (37.5 mg/mL) 为色谱峰 5（图 2）。所有化合物均溶于 DMSO 中。色谱和质谱条件表 2. Agilent 1260 Innity 自动化液质联用纯化系统的组件编号说明部件号1 Agilent 1260 Innity 制备泵G1361A、G1391A2 Agilent 1260 Innity 双定量环自动进样
9、器G2258A3 Agilent 1260 Innity 等度泵G1310B4 Agilent 1260 Innity 二极管阵列检测器G1315C5石英流通池，光程长度 10 mm G1315C#0186 Agilent 1200 系列色谱柱组合架G1383A7 Agilent 1260 Innity 制备型馏分收集器G1364B8安捷伦主动分流器G1968D9 Agilent 6100 系列单四极杆质谱仪G6130B表 3. 普通分析型方法参数和流速：见色谱图（图 2）参数值分析进样量与流速Agilent 1290 Innity 二元液质联用系统：1 L，流速：1 mL/minAgilen
10、t 1260 Innity 二元液质联用系统：1.7 L，流速：1.75 mL/minAgilent 1220 Innity 液相色谱系统：3.3 L，流速：1.75 mL/minAgilent 1260 Innity 自动化液质联用纯化系统：5 L，流速：1.75 mL/min紫外波长（分析型与制备型）280 nm，带宽 70 nm，无参比分析型梯度曲线图 2 显示了分析型梯度曲线。自动化聚焦制备型梯度根据分析方法筛选运行的结果自动生成。通过分子式/质量数鉴定目标化合物。制备型流速30 mL/min进样量650 L参数值扫描/碎裂参数电离模式API-ES，正/负切换循环时间百分比/极性50.
11、0 %扫描质量范围（正和负模式）125 725碎裂电压70 VEMV 增益1.0阈值150步长0.20MSD 雾化室干燥气温度350 C干燥气12.0 L/min雾化器压力50 psig四极杆温度350 C毛细管电压正离子：3100 V 负离子：3000 V表 4. 质谱条件4中的目标化合物。系统自动化创建定制聚焦制备梯度，并将其用于提高系统的纯化效率 （图 3）。用户界面显示了所选分析型系统和制备型系统组合中的流路特性（图 4）。为简化数据文件传输，将分析型 HPLC 和 UHPLC 系统通过网络与纯化系统连接。分析数据文件可上传至安捷伦自动纯化软件。处理完分析结果文件后，可做适当调整以优化
12、梯度曲线、纠正样品瓶位置、进样量与目标质量数（图 5）。纯化过程采用四台不同的分析型系统，通过对安捷伦自动纯化软件进行编程来上传与处理不同的分析数据文件并纯化所分析的样品。开始设置时，首先输入流路特性以及分析型系统中的色谱柱尺寸。输入制备型系统性质与色谱柱尺寸这些必填参数后，所有实验参数都将保存为数据文件。选定四台分析型系统与制备型系统的可能组合，并将其保存为不同的模板文件。在数据处理步骤中，利用质谱鉴定每幅分析色谱图结果与讨论分析结果将混标分别进样至四台不同的色谱系统中。图 2 显示了结果、进样量、色谱尺寸和梯度曲线。目标化合物在所有色谱图中均突出显示，并在质谱数据得到处理后通过软件实现鉴定
13、。所有色谱图的运行时间均不相同。在每幅色谱图中，目标化合物洗脱的保留时间各不 相同。图 2. 四台不同的分析型系统液相色谱系统采集到的结果。洗脱顺序为色谱峰 1：咖啡因，色谱峰 2：4-羟基苯甲酸甲酯，色谱峰 3：4-羟基苯甲酸乙酯，色谱峰 4：4-羟基苯甲酸丙酯及色谱峰 5：4-羟基苯甲酸苯甲酯min2 4 6 8 10 12 14Agilent 1260 Infinity BN#e#e90.485 mL4.6 50 mm, 1.8 uni00B5m, 1.75 mL/min0.50 24.50 985.00 98Agilent 1220 Infinity BN#e#e90.960 mL4.
14、6 100 mm, 3.5 uni00B5m, 1.75 mL/min1.00 29.00 9810.00 98Agilent 1260 Infinity 2BC#e#e91.1 mL4.6 150 mm, 5 uni00B5m, 1.75 mL/min1.50 2IX (min)%BIX (min)%BIX (min)%BAgilent 1290 Infinity BN#e#e90.195 mL2.1 50 mm, 1.8 uni00B5m, 1 mL/min0.10 21.50 981.70 98IX (min)%B13.509815.0 844 %44 %1234544 %44 %5图
15、3. 系统选择窗格：其中选择了分析型和制备型系统的可能组合#e5图 4. 显示系统参数的概览窗口图 5. 查看并修改样品瓶位置、目标质量数与进样量的分析结果上传视图tBl#TtB1#9#6将测试混标中所有化合物的洗脱点列于表中并进行了对比。所有洗脱点的允许误差均处于 2% 以内（表 5）。处理完分析数据文件后，图 7 所示的分析结果浏览器将（突出）显示鉴定出的目标色谱峰，并以概览方式显示所有采集到的质谱数据信息。脱化合物的有机溶剂百分比仍保持恒定，其允许误差处于 2% 以内。安捷伦自动纯化软件的算法根据洗脱所需的有机溶剂百分比计算聚焦梯度曲线，因此曲线不受化合物保留时间的影响。无论采用何种分析型系统采集数据，安捷伦自动纯化软件都会生成有效的聚焦梯度曲线。为证实软件在使用不同分析型系统时的自动纯化能力，对全部四个分析结果文件均进行上传与处理（图 6）。算法可计算出分析运行中用于洗脱目标化合物的有机溶剂百分比。即使采用不同的色谱柱尺寸、流速和梯度曲线3，流动相中用于洗8z
