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1、抗生素发酵工艺,一、概述 利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。,绪论,二、抗生素的发展史,我国早在宋朝真宗（998-1022）年代就开始利用接种人痘的免疫技术预防天花病。 1796年英国医生E.Jenner利用接种牛痘苗预防天花并获得成功。,1929：Fleming在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。1939：牛津病理家Howard Florey，化学家Ernst Chain
2、，Norman Heatley.发酵瓶培养霉菌，培养里提取测活性，青霉素结晶。,1940:8只注射链球菌，提取物对4只治疗。未经治疗鼠在24小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。1941年2月开始治疗第一批人类病人。1943：威斯康辛大学小组，取得突破生产菌表面培养：几十个单位深层培养产黄青霉：100U/mlX、UV诱变育种：1000-1500U/ml不产色素变种：66000-70000U/ml,1941年，美国辉瑞制药公司开始介入青霉素的试验性生产，使用了生产柠檬酸已经非常成熟的通入无菌空气并进行搅拌的深层发酵法。这种方法给发酵工业带来了革命性的变化。自此以后制药业走进了抗生素时代我国微生物发酵
3、制药工业起步较晚，1953年，我国第一家青霉素生产厂上海第三制药厂才建成投产。1958年，我国最大的抗生素制药企业华北制药厂在石家庄建成投产，主要产品为青霉素、链霉素、土霉素和红霉素等。,三、抗生素药物的分类,抗细菌：青霉素、红霉素、四环素抗真菌：两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素抗肿瘤：丝裂霉素、诺卡霉素抗病毒：阿糖腺苷、金刚烷胺,四、微生物发酵研究范围,微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。研究内容包括微生物制药用菌的选育，发酵以及产品的分离和纯化工艺等。 主要讨论用于各类药物发酵的微生物来源和改造、微生物药物的生物合成和调控机制、发酵工艺与主要参数的确定、药
4、物发酵过程的优化控制、质量控制等。,第一章 微生物药物的产生菌,常见的制药用微生物 细菌 放线菌 真菌,细菌之芽孢杆菌属(Bacillus),放线菌,抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。,放线菌之诺卡氏菌属 (Norcadia),生产利福霉素、蚊霉素等,放线菌之小单胞菌属 (Micromonospora),多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M. echinospora)产庆大霉素。,放线菌之游动放线菌属 （Actinoplanes）,典型代表： 济南游动放线菌 (Actinoplanes tsinanesisn) 产创新霉素(creatmycin；1964),真菌之曲霉属(A
5、spergillus),生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。,真菌之青霉属(Penicillum),产黄青霉(Penicillum chrysogenum) 生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸,真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium),产黄头孢霉(Cephalosporium chrysogen)、顶孢头孢霉菌(Cephalosporium acremonium) 都生产头孢菌素C,第二节 制药微生物的育种,菌种选育菌种筛选菌种保藏菌种的退化和复壮,一、发酵菌种的选育要求,生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类
6、似代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素,发酵菌种的选育方法,从自然界中获得新菌种诱变育种杂交育种原生质体融合基因工程,（1）从自然界中获得新菌种,土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等基本程序： 采样预处理富集培养筛选鉴定野生型菌株,（2）诱变育种,物理或化学方法诱发突变物理诱变剂：紫外线、X-射线、-射线等化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等,杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换基因工程育
7、种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广,二、菌种筛选,（1） 随机筛选 摇瓶筛选法、琼脂块筛选法（2）理性化筛选 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 筛选营养缺陷型突变株,三、菌种保藏(Culture conservation),目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。,原理：根据微生物的生理、生化特性，人工创造条件（如干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使微生物代谢活动处于不活泼状态，使其存活且得以延续。在进行保藏时最好是选用菌种的休眠体，如芽孢、孢子。通过保藏可以减少微生物的新陈代谢，降低菌种变异的几率。,菌种保藏三要素,典型
8、菌种的优良纯种的休眠体；创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）；尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。,菌种保藏的常用方法,斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法,菌种保藏机构ATCC（美国典型菌种保藏中心）CMCC (中国医学微生物菌种保藏管理中心)NBRC (日本技术评价研究所生物资源中心),四、菌种的退化和复壮,退化： 基因突变 连续传代 环境不良或污染了杂菌,生产能力下降抵抗不良环境条件能力减弱,复壮,纯种分离 粗放、精细寄主复壮选择合适的培养条件 改变营养成分、酸碱度、培养温度,第二章 培养基,
9、第一节 培养基的成分,原则： 根据菌种特性、微生物生长发育阶段、发酵产物特点等因素合理配制使用不同成分及配比的培养基，为微生物提供适宜的营养物质，以满足菌体生长和合成产物的需求。,一、碳源 工业常用： 糖蜜（营养丰富，物美价廉） 玉米淀粉及其水解液（克服葡萄糖代谢过快的弊病） 油脂（消除泡沫） 糊精,第一节 培养基的成分,二、氮源,有机氮源： 黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉无机氮源： 铵盐、硝酸盐、氨水,三、无机盐和微量元素,磷（链霉素、四环素）硫（青霉素、头孢菌素）铁（青霉素、四环素、麦迪霉素）镁（卡那霉素、新生霉素、链霉素）锌（链霉素、青霉素）氯（金霉素、灰黄霉素）,四、
10、前体,前体是指加入到发酵培养基中的能够直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去而自身结构没有显著变化的一类小分子物质。 注意：少量多次,五、促进剂和抑制剂,促进剂是指那些既不是营养物质又不是前体却能提高产物产量的添加剂。 抑制剂是指在发酵过程中会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需的某种产物或是正常代谢的某一代谢中间产物积累起来。,六、生长因子,那些对微生物生长不可缺少的微量有机物质，微生物不能通过普通的碳源、氮源合成这些物质，需另外添加，包括维生素、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱及其衍生物。,第二节 培养基的类型,类别：按组成成分分 合成培养基：成分明确、稳定，多
11、用于研究和育种，不适合大规模生产。 天然培养基：天然动植物产品，营养丰富、价格低廉、适于工业生产。,按培养基的物理状态分,固体培养基：适合菌种的培养和保存半固体培养基液体培养基：适合发酵工业大规模使用,按培养基的生产用途分,孢子培养基 供菌种繁殖孢子用的，常采用固体培养基。 条件：培养基营养不要太丰富 无机盐浓度适当 培养基的PH值要适中 常用：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米培养基,二、种子培养基,种子培养基是供孢子萌发和菌种生长繁殖用的培养基，营养成分要比较丰富、完全、易被菌体利用。 营养成分：葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硫酸铵等。,三、发酵培养基,发酵培养基是供菌种生长
12、、繁殖和合成产物用的培养基。 注意：碳氮源速效和迟效的相互搭配，少用速效营养，多加迟效营养，比例适宜。,第三节 培养基的设计与选择,一、培养基的设计 遵循的原则： 1、营养物质满足微生物生命活动的需要 2、营养物质的浓度及配比适当 3、PH值适宜 4、符合培养的目标 5、原料来源广泛，价格合理,二、培养基的选择,1、液体培养基和固体培养基的选择 液体培养基：种子培养及大规模发酵生产。 固体培养基：微生物菌种的分离、纯化及保存、菌落特征鉴定、活细胞数目测定2、根据微生物的营养特点选择培养基,3、依据生产实践和科学实验的要求选择培养基4、考虑培养基的成本 选择原则： 产物或菌体得率大的 降低产品的
13、分离提纯成本 生产能力最高的 副产品生成最少 原料质量稳定，供应充足 工艺过程较易进行,第四节 影响培养基质量的因素,一、培养基组成配比的影响二、培养基原材料质量的影响三、水质的影响四、灭菌的影响五、其他因素的影响,一、培养基组成配比的影响,氮源过多：菌体生长旺盛，PH值偏高，不利于代谢产物积累。氮源不足：菌体繁殖量过少，影响产量。碳源过多：PH值偏低。碳源不足：易引起菌体衰老和自溶。,二、培养基原材料质量的影响,有机氮源（黄豆饼粉、玉米浆）、配制培养基（蛋白胨）、碳源（油脂） 消除原则：在工业生产中必须严加控制，按质量标准进行分析检验，合乎标准的原材料方能使用。,三、水质影响,孢子培养基用蒸
14、馏水货深井水，种子培养基、发酵培养基用深井水或自来水，发酵生产中有的使用地表水，但是必要时要经过适当处理才能使用。,四、灭菌的影响,严格控制灭菌操作，力求达到既灭杂菌又减少营养成分的损失，对那些易降解或易发生化学反应的组分应单独灭菌。,五、其他因素影响,1、培养基的PH值 培养基PH值的调节应主要通过改变培养基营养物质的浓度比例，特别是生理酸、碱性物质的用量来完成。少量培养基的PH值可用缓冲液加以缓冲。2、培养基的黏度 黏度适宜,第三章 灭菌,第一节 灭菌的原理和方法 灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除掉物料及设备中所有生命有机体的过程。一、常用的灭菌方法 化学物质灭菌 辐射灭菌 过滤介质灭菌 加热灭菌（干热灭菌、湿热灭菌）,
