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1、黄酮类化合物的检识与结构测定,目前主要采用的方法有：与标准品或与文献对照PPC或TLC得到的Rf或hRf值（Rf100）分析对比样品在甲醇溶液中及加入酸、碱或金属盐类试剂后得到的UV光谱1H-NMR 13C-NMR MS,一、层析在黄酮类鉴定中的作用,1. 纸层析(PPC) 苷类成分可采用双向展开，第一相展开采用醇性溶剂，如BAW系统（正丁醇： 醋酸：水4：1：5上层）；第二相展开用水性溶剂，如氯仿：醋酸：水（3：6：1） 苷元则多采用醇性溶剂。 花色苷及其苷元，可用含盐酸或醋酸的溶剂。,2. 薄层层析(TLC),）硅胶薄层 用于弱极性黄酮较好。 常用甲苯：甲酸甲酯：甲酸（5：4：1）；苯：甲
2、醇（95：5）或苯：甲醇：冰醋酸（35：5：5）等。 ）聚酰胺层析 适用范围广，可分离含游离酚羟基或其苷类。 常用展开系统：乙醇：水（3：2）；丙酮：水（1：1）等。 显色剂：紫外光；2%三氯化铝甲醇液； 1%FeCl3 / 1%K3Fe(CN)6(1:1)混合液。,二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用,可用于确定黄酮母核类型及确定某些位置是否含有羟基。 一般程序： 测定样品在甲醇中的UV谱以了解母核类型； 在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后测UV谱和可见光谱以了解3, 5, 7, 3, 4有无羟基及邻二酚羟基； 苷类可水解后（或先甲基化再水解），再用上法测苷元的UV谱以了解糖的连接位置。,（一）
3、黄酮类化合物在甲醇溶液中的紫外光谱,多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成： 带I在300-400nm区间，由B环桂皮酰系统的电子跃迁所引起；,带II在240-285nm区间，由A环苯甲酰系统的电子跃迁所引起。,不同类型黄酮类化合物的紫外光谱,2加入诊断试剂后引起的位移及结构测定,说明：,1）+NaOMe, OHOMe，红移 另有有3,4-OH或3,3,4-OH时，在 NaOMe作用下易氧化破坏，故峰有衰减。2）NaOAc为弱碱，仅使酸性较强者，如7,4-OH解离。,3）,形成络合物的能力：黄酮醇3-OH 黄酮5-OH（二氢黄酮5-OH） 邻二酚羟基 二氢黄酮醇5-OH邻二酚羟基和二氢黄酮醇5-
4、OH在酸性条件下不与AlCl3络合；但不在酸性条件下，五者皆与Al3+络合；形成络合物越稳定，红移越多。4）二者相减可检测邻二酚羟基。,从中药柴胡中得到山奈苷，酸水解PPC检查出鼠李糖，该苷及苷元的UVmax(nm)谱如下，解析结构。,山奈苷 带II 带IMeOH 265 345NaOMe 265 388 43，4-OHAlCl3 275 399 AlCl3/HCl 275 39954，5-OHAlCl3= AlCl3/HCl：无邻二酚羟基NaOAc 265 399带II无红移，无7-OH,山奈苷元 带II 带IMeOH 265 367NaOMe 276 424（分解） 带I红移57，且分解，
5、3，4-OHAlCl3 270 424AlCl3/HCl 269 424 54，5-OHAlCl3= AlCl3/HCl：无邻二酚羟基NaOAc 276 387带II红移11，7-OH,山奈苷元与山奈苷相比：山奈苷的带I(345nm)比山奈苷元的带I(367nm)紫移22nm，说明3-OH苷化。 山奈苷元与山奈苷的分析结果表明：苷元比苷多了3和7羟基，表明山奈苷是3，7位鼠李糖苷。,三、1H-NMR,常用溶剂：氘代氯仿（CDDl3），氘代二甲基亚砜（DMSO-d6），氘代吡啶（C5D5N）。也可将黄酮类化合物作成三甲基硅醚衍生物溶于四氯化碳中进行测定。,优点：无干扰信号，勿须昂贵的氘代试剂；供
6、试后的样品用含水甲醇处理可回收；三甲基硅醚衍生物可很方便的转变成乙酰衍生物或甲醚衍生物。,（一）A环质子,15, 7-二OH黄酮,27-OH黄酮,H-5较H-6、H-8低场，是由于羰基的负屏蔽效应的影响。H-6、H-8较5, 7-二OH黄酮低场，且相互位置可能颠倒。,（二） B环质子 6.5-8,14-氧取代黄酮类化合物,H-3, 5 6.5-7.1, d, J=8.5HzH-2, 6 7.1-8.1, d, J=8.5Hz由于C环对H-2, 6的负屏蔽作用大于对H-3, 5， 且H-3, 5受4-OR的屏蔽作用，故前者较低场；C环氧化程度越高，H-2, 6处于越低场的位置。,23, 4-二氧
7、取代黄酮类化合物,H-2受C环负屏蔽和3-OR屏蔽作用，H-6 也受C环负屏蔽作用，而H-5则仅4-OR屏蔽作用。故由低场到高场的顺序为：H-6 H-2 H-5。但有时也会发生H-2和H-6重叠的现象。,（1）3, 4-二氧取代黄酮及 黄酮醇H-5 6.7-7.1 d, J=8.5HzH-2 7.2 d, J=2.5HzH-6 7.9 dd, J=2.5, 8.5Hz,（2）3, 4-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇 H-2, 5, 6常作为一个复杂多重峰（通常为两组峰） 6.7-7.1,33, 4,5-三氧取代黄酮类化合物,若R1=R2=R3=H，则H-2, 6为单峰， 6.7-7.5若
8、上述条件不成立，则H-2, 6分别为二重峰（J=2Hz）,（三） C环质子,1. 黄酮类,2. 异黄酮类,H-2位于羰基位，同时受羰基和苯环的负屏蔽作用，且通过碳与氧相连，故较一般芳香质子低场，7.6-7.8。若用DMSO-d6作溶剂，则8.5-8.7。,3. 二氢黄酮和二氢黄酮醇,1) 二氢黄酮,两个H-3, 分别为dd峰，中心位于2.8 ，J = 17Hz（偕偶），5Hz（顺偶）及J = 17Hz（偕偶），11Hz（反偶）,H-2, dd, 5.2, Jtrans = 11Hz（反偶）, Jcis = 5Hz（顺偶）,（2）二氢黄酮醇,3-OR苷化，供电子能力下降，两个氢的值升高（向低场位
9、移），可用于判断二氢黄酮醇苷中糖的位置。,H-2与H-3为反 式双直立键， J=11HzH-2 4.9H-3 4.3,4. 查耳酮,5.橙酮,（四） 糖上的质子,1. 单糖苷类 糖与苷元相连时，糖上1-H与其它 H比较，一般位于较低磁场区。因-OR (R=苷元) 不表现供电子，仅表现吸电子的诱导作用，端基H受两个O的诱导，处于低场（4.0-6.0）,1）葡萄糖位于不同位置时端基H化学 位移的区别： C3-OR 1-H的 值约为5.8 C-5, C-6, C-7, C-4-OR 1-H的 值约为4.8-5.2,2) 葡萄糖苷与鼠李糖苷的区别 黄酮醇3-O-葡萄糖苷端基H 5.8, d, J=7H
10、z （二直立键偶合系统） 黄酮醇3-O-鼠李糖苷端基H 5.0-5.1, d, J=2Hz （二平伏键偶合系统） 另外鼠李糖上的C-CH3: 0.8-1.2, d, J=6.5Hz,2. 双糖苷类 末端糖上的H-1因离黄酮母核较远，受到的负屏蔽作用较小，因而叫H-1处于较高场的位置。（五） 其它质子 如6-及8-C-CH3，乙酰氧基质子，甲氧基质子。,四、13C-NMR,方法： 1）对比法：与简单的模型化合物如苯乙酮、桂皮酸及它们的衍生物光谱的比较； 2）计算法：用经验的简单芳香化合物的取代位移加和规律进行计算； 3）选用各种一维和二维NMR技术。,（一）骨架类型的判断,根据中央三碳链的碳信号
11、，即先根据羰基碳的值，再结合C2、C3的裂分和值判断。,（二）黄酮类化合物取代图式的确定方法,黄酮类化合物中芳香碳原子的信号特征可以用来确定取代基的取代图式。以黄酮为例，其13C-NMR信号如下所示：,1取代基位移的影响,-OH及-OCH3的引入将使直接相连碳原子(-碳)信号大幅度地向低场位移，邻位碳原子(-碳)及对位碳则向高场位移。间位碳虽也向低场位移，但幅度很小。,25，7-二羟基黄酮类中C-6及C-8信号的特征,对大多数5，7-二羟基黄酮类化合物来说，C-6(d)及C-8(d)信号在90.0100.0的范围内出现，且C-6信号总是比C-8信号出现在较低的磁场。在二氢黄酮中两者差别较小，约
12、差0.9个化学位移单位，但在黄酮及黄酮醇中差别较大，约为4.8。C-6或C-8有无烷基或者芳香基取代可通过观察13C-NMR上C-6，C-8信号是否发生位移而加以认定。,生松素(pinocembrin)及其6-C-甲基及8-C-甲基衍生物的C-6，C-8,木犀草素(1uteolin)，即使因其C-6上联接的H被-OH取代而向低场大幅度的位移，C-8信号也未因此而发生大的改变。,芹菜素(apigenin)、肥皂黄素(saponarin)及apigenin-6, 8-di-C-glucosideC-6,C-8数据,(三)黄酮类化合物O-糖苷中糖的连接位置,1糖的苷化位移及端基碳的信号 酚性苷中，糖
13、上端基碳的苷化位移约为+4.0+6.0。 黄酮苷类化合物当苷化位置在苷元的7或2、3、4时，糖的C-1信号将位于约100.0102.5范围内。 5-O-葡萄糖苷及7-O-鼠李糖苷相应的糖的C-1信号分别出现104.3及99.0处。,2苷元的苷化位移,苷元糖苷化后与糖直接相连碳原子向高场位移，其邻位及对位碳原子则向低场位移，且对位碳原子的位移幅度大而且恒定。,五、质谱在黄酮类结构测定中的应用,多数黄酮类化合物苷元在电子轰击质谱(El-MS)中因分子离子峰较强，往往成为基峰，故一般无须作成衍生物即可进行测定。 但是当测定极性强、难气化以及对热不稳定的黄酮苷类化合物时，则采用FD-MS和FAB-MS
14、、ESI-MS等软电离质谱技术获得强的分子离子峰M+及具有偶数电子的准分子离子峰(quasi-molecularion peak) M+H +。,(一)黄酮类化合物苷元的电子轰击质谱 (El-MS),黄酮类化合物苷元的El-MS: 分子离子峰M+ M-1+即(M-H)基峰 甲基化衍生物，则可以得到M-15+即(M-CH3)离子。,黄酮类化合物主要有下列两种基本裂解途径：,途径-I（RDA裂解）： 120 102,途径-II,此外，还有分子离子M+.生成M-1+，M-28+.，(M-CO)；由A1生成A1-28+.，(A1-CO)及B2生成B2-28+，(B2-CO)等碎片离子。,1黄酮类裂解基本规律：,
