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1、中国药物与临床2009年lO月第9卷第lO期Chinese Remedies&ClinicsOctober 2009，V019，No10port of 4 ca8Arch Pathol Lab Med2003，127(I)：321-3253 Yano M，Yamakawa Y，Kidyama M，et a1Sclerosing hemangiomawith眦tast艄to multiple nodlll stationsAnn Thorae surg，2002，73(3)：981-9834 Yousem SA，Wick MR，Singh G。ct a1so-called sclerosing
2、he-mangiomas of the lungAm J Surg Pathol，1988。12：5825 Bejarano PA。Baughman RP，Biddinger PW，et a1Surfactant p驴teins and thyroid transcription factor-I in pulmonary and breastcarcinomasMed Pathoi，19969：445-4526 陈岗上皮膜抗原表达与胸腺瘤侵袭性的相关性分析中国癌症杂志，1999，9(4)：284-2867 李维华，许红民，李红芬等肺的一种良性神经内分泌肿瘤：对所谓肺硬化性血管瘤来源的探讨中华
3、病理学杂志，1994，23(2)：69729598 孔洁，易祥华张韵肺硬化性血管瘤组织发生学的初步研究临床肺科杂志，20038(5)：456-4599 嵇学仙，倪型灏疗铣华，等肺硬化性血管瘤临床病理分析肿瘤研究与临床，2006，18(1)：424410 仲氕郑世营陈锁成等CD44v6在肺癌组织中的表达及意义江苏医药2005，31(3)：1641661l 王妍戴顺东下恩华所渭肺硬化性血管瘤组织中两种主要细胞的基因表达差异及意义中圆肺癌杂志，200710(6)：46647012 Niho S，Suzuki K，Yokose T，et a1Monoclonality of boh pale cell
4、sand cubodal cells of selerosing hemangioma of the lungAm JPaht011998。152(4)：1065-1069(收稿日期：200907一lO)骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞亚群活性以及表达TGF13，的影响孟利花史玉亮赵秀娟高志林目前认为再生障碍性贫血(AA)通常是南免疫因素介导的L J-A，具有与其他自身免疫性疾病相类似的病理学发病机制，T细胞哑群的紊乱和活化状态T细胞的增加是AA免疫病理机制的生物学基础fsl，转化生长因子(TGF)一B，是参与AA发病的蘑要致病性细胞因子之一。近来。具有免疫调节作用的骨髓间充质干细胞
5、(MSC)是研究的热点。已有学者报道使用MSC作为免疫抑制剂治疗自身免疫性疾病r6】本文检测了35例再生障碍性贫血患者的T细胞与正常MSC共孵育前后T细胞亚群和活性的改变，以及单个核细胞(MNC)分别和正常MSC、AA MSC共孵育前后TGFBl的改变，试图为MSC临床上应用于治疗AA提供理论依据。1资料与方法11临床资料患者组35例，男性2l例，女性14例，年龄4582岁，平均(5812)岁均为太原市中心医院血液科经临床明确诊断AA患者。符合1987年美国风湿病协会修订的AA诊断标准。健康对照组35名，男性24名，女性11名，年龄4566岁，平均(5212)岁。均为太原市中心医院经健康体检合
6、格的健康志愿者，无心、肝、肺、肾等重要脏器疾患，肝、肾功能试验正常，血清类风湿因子检测为阴性。12方法121上清液的分离：分别取健康对照和患者清晨空腹肘正中静脉血各10 ml，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，在4作者单位：030009太原市中心医院血液科通信作者：赵秀娟。Email：zhaoxiujuan20056sinacomh内离心3000 dmin 10 min收集1-清液，封闭于Eppendorff管内一24冰箱保存待检。122单个核细胞的分离培养：经肝素抗凝的新鲜血用磷酸盐缓冲液(PBS)倍比稀释后，以淋巴细胞分离液(1077咖l，上海惯信试剂有限公司)分离，吸取中间单个核细胞
7、层。磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次。计数后，用含50FBS的RPMll640培养基(Gib公司)悬浮，调整细胞浓度为5x107ml备用。123 T细胞的制备：取健康对照和AA患者(来自太原市中心医院)清晨空腹肘正中静脉血各10 ml，肝素抗凝后用PBS倍比稀释以淋巴细胞分离液(1077 gml，上海恒信试剂有限公司)分离，吸取中间单个核细胞层备用。称取6 g干燥尼龙毛使之松散填充于lO IIll玻璃注射器套管内，尼龙毛柱体积约6 m1用无菌生理盐水反复冲洗，i通阀门高压蒸汽灭菌30 min，备用的单个核细胞悬液过柱分离T细胞。124间充质干细胞的分离、培养及纯度鉴定：取健康人和AA患者的骨髓5
8、rIll经肝素抗凝，按文献7方法进行MSC分离、扩增。用PBS倍比稀释后，以PerColl(Pharmacia公司，比重1073 gm1)梯度离-1：,(900 gx30 min)吸取中间单个核细胞层用PBS离心洗2次，细胞计数，并以2x105ml的密度接种于培养瓶中。其培养体系为含经筛选的10的胎牛血清的低糖DMEM(Gibco公司)。37含5C02饱和湿度条件下培养。2448 h后去除悬浮细胞，换液。此后每隔34 d换液，当贴壁细胞层达到90以上融合时，以025胰蛋白酶消化传代。传至第3代以后的细胞备用。进行流式细胞术分析鉴定以及确定所分离培养的MSC的纯度。中闻药物j临床2009年10月
9、第9卷第10期Chinese Remedies&一Clinics,October 2009,V019,No10125 MSC作为滋养层与AA单个核细胞共孵育：传至第三代后的MSC经鉴定后铺于6孔板内，接种密度为6000+Icm2。待细胞牛长至板底90融合时，60co照射去除其分化能力及过度增殖能力。选取形态及密度均合适的孔内的MSC作为滋养层细胞培养AA单个核细胞，培养于24孔板，每孔20 ml，细胞数为2l 05ml，每组设2个复孑L。放置于37 oC，5C02孵箱中培养14 d，3-4 d换液。126 MSC作为滋养层与AA T细胞共孵育试验：传代至45代时收获细胞，选取形态及密度均合适的
10、孔内的MSC作为滋养层细胞。分如下4组进行实验：A组：正常T细胞；B组：AAT细胞；C组：MSC+正常T细胞；D组MSC+AA T细胞。每孔细胞数为2xl 06ml。每组设3个复孔。放置于37，5C02孵箱中培养7 d。127 TGF一81基因和蛋fLl的检测：共孵育14 d后，分别收集细胞和上清液反转录一聚合酶链反应(RTPCR)和酶联免疫吸附试验(E1。1SA)法分别检测共孵育Iii后细胞因子TNF一仪基闪和蛋白的表达。RT-PCR榆测按照试剂盒说明书进行。弓I物序歹U如下：TGFBl蛔5CAATICCTGGCGTTAcC11G35AGGAAGGGFCGGTICATGTC3。反应条件：95
11、预变性2 rain94 oC变性30 s。62退火50 s，72延伸1rain，35个循环。扩增片段长度为246 bp。PCR产物经15琼脂糖电泳分离后照相。TGF一13t13一aetin的平均灰度值对其进行半定幢。采用ELISA方法榆测f：清液TGF一8l的量，试剂盒为美陶C坩nzvme公司产品按试剂盒说明进行操作。13统计学处理计量资料实验数据以；s表示。2组资料均数之间的比较采用t检验。多组资料均数之间的比较采用方差分析和LSD检验。以PO05)，而CD8+细胞却明以后无明显卜降，孵育前后比较无统计学差异(乃005)。正常 显升高(P001)，导致CD4CD8+比值明显倒置(P001)，
12、这MSC能够调节TGF-BI的表达。实验组(Control MNC+AA 与文献1，8基本相符。这进一步提示CD8+细胞口I能参与r 中国药物与I床2009年lO月第9卷第lO期ChineseRemediesClinicsOctober 2009，V019，No10 。AA的免疫发病机制同时CD25和CD69是T淋巴细胞被刺激物激活增殖后在其表面早期表达的膜蛋白分子。是检测T淋巴细胞活性的重要指标。本研究显示，健康人外周血只有少量CD4+与CD8q淋巴细胞表达CD25和CD69，说明生理状态下T淋巴细胞处于静止状态，基本上无T淋巴细胞激活。而再生障碍性贫斑患者体内早期激活的T细胞却增多，提示再
13、生障碍性贫血患者体内T淋巴细胞被未知的抗原所刺激，处于“早期激活”状态w而CD69在T淋巴细胞表面长期表达，提示再生障碍性贫血患者体内的抗原刺激为持续存在，从而使CD69一直有表达。另外，CD4+CD25+Treg细胞在诱导和维持自身免疫耐受性和阻止自身免疫中起着重要作用，我们的结果显示，正常组与AA组相比有差异有统计学意义(P005)。提示Treg细胞减少可能在AA的发病中起作用，可能由于Treg细胞减少使机体免疫耐受失衡，从而对自身抗体产生免疫排斥，表明AA的主要病理机制是T细胞功能亢进引起的造血组织损伤的自身免疫性疾病。因此，再生障碍性贫血患者的免疫状态处于T细胞过度活化以及免疫耐受被打
14、破的状态，为了进一步研究MSC是否能调节再生障碍性贫血患者的过度免疫，应用MSC与AAT细胞共孵育，利用流式细胞仪检测共孵育前后T淋巴细胞亚群的改变。MSC与AAT细胞共培养7 d后CD3+T淋巴细胞较共孵育前(AAT)明最减少，差异有统计学意义(尸005)，CIMq淋巴细胞的比例mlj较对照组有明昆增高(P005)，CD8+T淋巴细胞的比例则较对照组有明显下降(尸005)，但CD47CD8+略有上升。进一步榆测共孵育前后T淋巴细胞活性的改变结果显示MSC和AAT淋巴细胞共培养后，表面抗原CD69的表达率较对照组下降(P005)表面抗原CD25的表达率较对照组下降(尸005)，即MSC和AAT
15、淋巴细胞共培养后总体活化T细胞的数有所降低(PO05)。0)4+CD25+的表达率较对照组增高(P005)，即总体活化T辅助细胞的数有所上升(PO05)。Le Blanci，3的实验结果认为。只要MSC的数量达到T淋巴细胞数量的10或以上抑制的作用就会发生，而且MSC的数量与抑制效果成讵相关：而另一个方面，如果MSC的数黾仅仅为T淋巴细胞数量的l或以下，那么这样的抑制作用便不会发生。国内诸多体外实验证实，MSC具有抑制异基因淋巴细胞增殖作用，且有剂量依赖性，但其作用机制尚不十分清楚。陆晓茜等“01认为。MSC可能是通过细胞间相互作用及诱导T淋巴细胞亚群由Thl，Tcl向Th2Tc2极化有关；宁红梅等】体外实验研究提示，MSC的免疫负调节作用可能与诱导CD4+CD25+免疫调节性rr细胞增高有关。围外文献f 6报道，在Dc细胞与MSC共培养后，在DC培养上清液中TNFd含揖明显减低而在Dc培养上清液中肿瘤坏死因子(IL)一10含量明显增高。说明MSC可通过抑制DCs分泌TNF-ct而下调成熟DCs表面受体，同时增加负调节细胞因子的分泌进而导致其诱导异基因T细胞增殖作用下降。想健康人MSC是否也能调节AA紊乱的免疫功能呢?我们运用MSC铺板培养AA单个核细胞96l (MNC)RT-PCR、ELISA分别检测TGF-B1基因和蛋白，表明AA患者MSC不能为MN
