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1、临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 1 页第十一章生物素- 亲和素放大技术第一节 生物素的理化性质与标记第二节 亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记第三节 生物素物素物素的理化性质与标记生物素（亲和素（一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。生物素一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。 生物素（）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。一、活化生物素生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志
2、物。 利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素 （一）标记蛋白质氨基的活化生物素（二）标记蛋白质醛基的活化生物素（三）标记蛋白质巯基的活化生物素（四）标记核酸的活化生物素 生物素化蛋白质衍生物有两类：二、生物素标记蛋白质（一）抗原、抗体 酶）结合生物素后制成的标志物 （二）标记方法 原 抗体是常用的生物活性大分子物质。由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。为适用于不同的抗原抗体反应体系，通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。物素标记辣根过氧化物酶 （三）基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（
3、酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标志物的活性。分子物质造成的空间位阻影响，有利于生物素与亲和素的结合，可临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 2 页在生物素与被标志物间加入交联臂样结构。体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素（链霉亲和素（合。亲和素或链霉亲和素的上述特性，是建立生物素
4、霉亲和素）放大技术的重要基础。一、亲和素及其活性耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，尤其是与生物素结合后，稳定性更好。每个亲和素能结合 4 个分子的生物素，二者之间的亲和力极强。二、链霉亲和素及其活性链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，一个链霉亲和素分子也能结合 4 个生物素分子。 三、亲和素（或链霉亲和素）的标记用于标记亲和素或链霉亲和素的小分子示踪物有 125、胶体金、荧光素和化学发光物，大分子物质如酶、抗原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等，其中最常用的是酶、异硫氰酸荧光素（胶体金。 可以通过与生物素化酶复合物中的生物素结合，间接地与酶形成结合物。 （一）改良过碘酸钠法（2）合物的制备（二）
5、合物的制备采用过碘酸钠法直接标记 合物的制备 合物的制备采用戊二醛二步法 第三节生物素、灵敏度生物素与蛋白质和核酸类等生物大分子结合形成的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比活度高，具多价性。此外，每个亲和素分子有四个生物素结合部位，可同时以多价形式结合生物素化的大分子衍生物和标志物。因此，有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。二、特异性亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，合特性不会因反应试剂的高度稀释而受影响，临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 3
6、 页使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异作用。三、稳定性亲和素与生物素间的亲和常数比抗原一抗体反应至少高 1 万倍，二者结合形成的复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，实际应用中，产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。四、适用性生物素和亲和素均可制成多种衍生物，不仅可与酶、荧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用于检测体液、组织或细胞中的抗原素且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。五、其他依据具体实验方法要求制成多种通用性试剂（如生物素化第二抗体等），适用于不同的反应体系；而且都可高
7、度稀释，用量很少，实验成本低；尤其是 成本高昂的抗原特异性第一抗体偶联使用，可使后者的用量大幅度减少，节约实验费用。此外，由于生物素与亲和素的结合具高速、高效的特性，尽管 反应层次较多，但所需的温育时间不长，实验往往只需数小时即可完成。第四节生物素别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素，称为 ；后来又在其基础上发展了亲和素 A 法，或称标记亲和素 依据待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，又分为直接法 间接法（一）也称为桥联亲和素是以游离的亲和素（或链霉亲和素）作为桥联剂，利用亲和素的多价性，将检测反应体系中抗原酶标生物素）连接起来，达到检测反应分子的目的。 （
8、二）原理是预先按一定比例将亲和素与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素生物素 当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原记体系连成一体进行检测。 二、生物素） 的应用把 联起来，可大大提高 定的灵敏度：每个亲和素可结合 4 个生物素，可使反应明显放大；亲和素与生物素间极高的亲和力，使反应结合更牢固稳定，而且特异性高；用小分子生物素代替酶标记抗体，可减少反应中的空间位阻 临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 4 页（二）生物素、生物素于荧光抗体技术，通常采用 ，即用荧光素直接标记亲和素（或链霉亲
9、和素）；也可采用游离亲和素（或链霉亲和素）搭桥，两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素（）或荧光标记的抗亲和素（或链霉亲和素）抗体的夹心法。酶放大时间分辨荧光免疫分析（是在抗原与固相 生物素化 应形成夹心复合物后，加入碱性磷酸酶（记的 续反应，经生物素和 高亲和力结合，形成复合物：固相 （作用底物生成产物 5者在碱性条件下，可与 成荧光寿命长且产额高的三元复合物用于检测。四、生物素要与免疫放射分析（测体系偶联，用于对终反应的放大（）。此外，可用于 应后 B，F 成分的分离。该法的优点是克服了其他 测复合物与固相结合更牢固，操作更简便。五、生物素分子生物学领域中的应用日渐增多，目前主要集中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测，用 备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化以及将免疫测定技术与 合建立免疫于抗原的检测等三方面。
