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1、临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 1 页第十章化学发光免疫技术第一节 概述 第二节 化学发光剂和标记技术 第三节 化学发光免疫分析的类型第一节概述发光免疫分析是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。这种方法兼有发光分析的高灵敏性和抗原抗体反应的高特异性。发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为光照发光、生物发光、化学发光等。光照发光是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态
2、时，发射出较长波长的可见光（荧光）。生物发光是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素。实际上，生物发光就是发生在生物体内的一种化学发光。二、化学发光效率化学发光反应的发光效率又称化学发光反应量子产率。化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。因此，可设计出不同的反应模式。 第二节化学发光剂和标记技术一、化学发光剂在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物 （一）直接化
3、学发光剂直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。传统的化学发光标志物有鲁米诺和吖啶酯。但由于鲁米诺作为酶促反应发光剂优于直接标记发光，故吖啶酯是目前常用的直接标记发光剂。碱性条件下被 出波长为 470光，具有很高的发光效率，其激发态产物 啶酯类发光剂可直接用于标记半抗原和蛋白质等。用于标记抗体时，结合稳定，结合后并不减少光量子的产生，可获得高的比活性，有利于双位点化学发光免疫分析的建立。联吡啶钌是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。 （二）酶促反应发光剂 利用标记
4、酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。目前化学发光酶免疫分析中常用的标记酶有辣根过氧化物酶（碱性磷酸酶。辣根过氧化物酶催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物；碱性磷酸酶催化的发光底物为 临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 2 页二、发光剂的标记技术发光剂的标记是通过化学反应将发光剂连接到抗体或抗原上。标记反应分为“直接偶联”和“间接偶联”两种方式。 （一）二）影响标记的因素 具有较高的纯度和免疫学稳定性；抗体作为被标志物时，则要求具有较高的效价，应用提纯的 代替全血清。 正确选择与发光剂和被标志物结构相适应的偶联方式。 体）结合物时，光剂：交
5、联剂的克分子比（影响结合物的发光效率。 发光剂之间的克分子比。由于每一种发光剂对应子被标志物都有特定的最佳标记率，标志物选择不好，会造成标记率低、不易保存等现象。 于较稳定的小分子被标志物，温度可稍放宽些；而当被标志物是抗原或抗体蛋白质时，由于蛋白质对热的不稳定性，应在保证标记反应进行的前提下，尽量选择较低的温度，以避免蛋白质在标记过程中活性的丧失。 用前都需进行纯化，除去未结合的发光剂和交联剂。一般可用透析法、凝胶过滤法和盐析沉淀法等进行纯化。纯化的结合物应及时测定蛋白质的含量、免疫学活性及发光效率等指标。结合物一般可分装保存在70条件下，最好冷冻干燥保存。 第三节化学发光免疫分析的类型一、
6、直接化学发光免疫分析直接化学发光免疫分析是用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体（抗原），与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体时只需加入氧化剂（H 2 正液（呈碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光，由集光器和光电倍增管接收，记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。吖啶酯化学发光的特点：推动者发光的氧化反应简单快速，不需要催化剂，只要在碱性环境中即可进行；反应体系中加入 液后，发光迅速，背景噪声低，保证了测定的敏感性；吖啶酯可直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标志物的生物学活性和理化特性；吖啶酯发
7、光为瞬间发光，临床医学检验技士考试辅导临床免疫学和免疫检验 第 3 页持续时间短，因此，对信号检测仪的灵敏度要求比较高。二、化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（碱性磷酸酶（标记抗体（或抗原），与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体一待测抗原一酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光。由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。三、电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（一般化学发光分析不同，是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗
8、体（抗原），以三丙胺（电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体（抗原），用三联吡啶钌标记抗体（抗原），在反应体系内待测标本与相应的抗体发生免疫反应，形成磁性微粒包被抗体一待测抗原一三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸人流动室，同时引入 冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和 电极表面进行电子转移，产生电化学发光。光信号由安装在流动室上方的光信号检测器检测，光的强度与待测抗原的浓度成正比。四、临床应用由于化学发光免疫测定技术无放射性污染，同时能达到放射免疫测定的灵敏度，而且还具有快速、准确、特异、可自动化等特点，因此已广泛应用于各种激素、肿瘤标志物、药物浓度及其他微量生物活性物质的测定。一、化学发光化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质（发光剂）在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。
