金黄色葡萄球菌检测方法

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1、金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。采用快速测试片检测具有显著的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。此方法现在应用于快速检测领域，美国3M 公

2、司 Petrifilm 为载体的测试片应用最为广泛。但其也存在一些问题：Petrifilm 测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm 测试片面积较小，当菌量大于250cfu 时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。使目视效果下降，导致计数偏低。2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两

3、种方法均能判断机体的感染状况。目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素 A、B、C 的抗体。毒素抗体优势在于敏感度高，易于检查，缺点毒素种类多，检测其中几种不具有普遍性。毒素分离工艺复杂，要得到纯毒素成本

4、比较高。（2）免疫学方法技术分析：上述免疫学技术应用最多的是酶联免疫技术和胶体金侧向层析技术。酶联免疫技术广泛应用于实验室检测，由于一次可以检测多个样本，此技术多用于体外诊断，目前也广泛用于食品安全。胶体金技术由于操作简单，检测适度快等优势，在食品安全领域广泛用于现场快速检测。基于免疫学方法的技术主要分为：酶联免疫技术、胶体金侧向层析技术、免疫荧光技术、免疫沉淀技术、乳胶凝集技术、免疫磁珠技术。3.分子生物学方法金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：肠毒素、血浆凝固酶、溶血素、杀白细胞素、表皮溶解毒素、毒性体克综合重量毒素 I 等。而这些致病因子基因的鉴定(包括耐药性相关

5、基因、毒素基因、酶基因及多种特异性鉴别基因)使得分子生物学检测成为近年来应用于食品中致病微生物快速检测的方法。基于分子生物学方法的技术主要分为：聚合酶链式反应 PCR 技术和实时荧光定量 PCR（rtPCR）技术、生物芯片技术、测序技术。分子生物学检测技术是检测技术的发展方向，是检测技术的未来，从DNA、RNA 角度深度检测。但是由于检测方法复杂，需要仪器设备及专业人员操作，对实验室环境有要求，检测成本高等因素，目前该技术没有广泛应用。针对市场上食品中金黄色葡萄球菌进行大批量的检测，是一件很不容易的事情。目前市场上还没有真正好的产品能够对金黄色葡萄球菌进行快速检测。首先要求检测速度快，目前的方

6、法大部分需要培养，至少2448小时，不利于现场检测，48小时以上商家才能拿到检测结果，才能进行市场销售，熟食就没有了新鲜度可言，所以检测速度成了菌类包括金黄色葡萄球菌检测的关键影响因素。其次是目前中国食品安全的重视度不够，一般市场没有相应的检测实验室和检测设备。上述需要仪器设备的检测方法完全行不通。熟食和冷藏食品中金黄色葡萄球菌数量很少，在10个以内，为快速检测增加了难度。而且人员素质低，专业人员比例少是客观存在的现实，不可能进行如分子生物学检测之类的实验，检测成本问题也不可忽视，百姓不希望在买菜的同时附加上一大笔检测费用。解决关键性问题可以提高检测速度，通过不断的研究和总结金黄色葡萄球菌快速

7、增殖的环境和条件，在增菌液中进行扩增，使菌数达到胶体金的检测下限，用胶体金方法检测，此方法检测时间为410个小时（其中金黄色葡萄球菌扩增时间为410小时，检测时间为3分钟） ，操作简单，不用任何实验室仪器设备，检测试剂盒价格低廉，比较适合金黄色葡萄球菌检测初筛。检测胶体金试剂卡分两种，一种是检测金葡菌肠毒素 ABC，另一种选取特异性菌壁蛋白，用基因工程方法合成抗原，对鼠进行免疫制出两株单克隆抗体，用双抗夹心法制成胶体金检测卡，对于金黄色葡萄球菌属检测率为96%。特异性实验证明与副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌小川型、O139型及569B 型等菌无交叉反应；假阳性率在5%以下、假阴

8、性率在1%以下；同一批次的试纸条10次重复试验结果一致。检测方法：将待检测食品取10g 食物样品在10%NaCl 溶液中涮洗5次，加入增菌液增菌（配合37手持小仪器使用可缩短增菌时间） ，加入菌裂解液摇匀，取3滴点板。结果判断如下图示：金黄色葡萄球菌仍然是食品安全的隐患，检测依然重要。人们吃上放心的食品是食品安全工作者的责任。希望今后能够继续开发出更好的金葡菌快速检测方法和检测试剂盒4 直接平板计数法（FDA BAM &ISO）1.检样（50g+450mL 稀释液）2. 适当十倍稀释样品3.选择 23 个连续适宜稀释度4.吸取 1ml 菌液按照 0.3mL、0.3mL、0.4mL 分别涂布于3

9、 块 90mmBaird-Parker 平板上（做平行试验）35 ，4548 h5.确证试验报告FDA BAM 金黄色葡萄球菌检验MPN 法1.检样（50g+450mL 稀释液）2.适当十倍稀释样品3.选择 3 个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管 10% NaCl TSB 肉汤，每管接种 1mL35 ，48 2 h4.从生长的管中接种 1 环划线于 Baird-Parker 平板上35 ，48 h5.确证试验6.报告FDA BAM 金黄色葡萄球菌确证试验1.凝固酶试验方法：从平板上至少挑取 1 个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到 TSB/BHI 肉汤中，置 35培养 18-24h

10、。取肉汤培养物 0.3mL 同 0.5mL 凝固酶试验兔血浆充分混合，置 35培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察 6h。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。结果判定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。部分凝固（2+和 3+）的必须进行生化鉴定加以证实。FDA BAM 金黄色葡萄球菌确证试验2.革兰氏染色对所有的可疑培养物都要进行革兰氏染色。3.生化鉴定 过氧化氢酶试验葡萄糖厌氧利用试验甘露醇厌氧利用试验金葡溶菌酶敏感性试验 耐热核酸酶试验（辅助）ISO 金黄色葡萄球菌检验MPN 法1.检样（xg+9xmL 稀释液）2.适当十倍稀释样品3.选择 3 个适宜的连续稀释度的样品稀释

11、液，每个稀释度接种三管modified Giolitti and Cantoni broth，37 ，2448 h4.从变黑或出现黑色沉淀的管中接种 1 环培养物于 Baird-Parker 平板上37 ，48 h5.确证试验6.报告简 介金 黄 色 葡 萄 球 菌 细 胞 壁 含 90%的 肽 聚 糖 和 10%的 磷 壁 酸 。 其 肽 聚 糖 的 网 状 结 构 比革 兰 氏 阴 性 菌 致 密 ， 染 色 时 结 晶 紫 附 着 后 不 被 酒 精 脱 色 故 而 呈 现 紫 色 ， 相 反 ， 阴 性 菌 没有 细 胞 壁 结 构 ， 所 以 紫 色 被 酒 精 冲 掉 然 后 附

12、着 了 沙 黄 的 红 色 。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 与 青霉 素 的 发 现 有 很 大 的 渊 源 。 当 年 弗 莱 明 就 是 在 他 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的 培 养 皿 中 发 现 有些 球 菌 被 杀 死 了 ， 于 是 发 现 了 青 霉 素 。 而 研 究 也 表 明 青 霉 素 只 对 以 金 黄 色 葡 萄 球 菌 为 代表 的 革 兰 氏 阳 性 菌 作 用 明 显 。 这 也 是 由 肽 聚 糖 层 的 厚 度 和 结 构 造 成 的 。 新 出 现 的 耐 甲 氧西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ， 被 称 作 超 级 细 菌 ， 几 乎 能 抵

13、抗 人 类 现 在 所 有 的 药 物 ， 但 是 万 古霉 素 可 以 对 付 它 。 典 型 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 为 球 型 ， 直 径 0.8m 左 右 ， 显 微 镜 下 排 列成 葡 萄 串 状 。 显 微 图 像金 黄 色 葡 萄 球 菌 无 芽 胞 、 鞭 毛 ， 大 多 数 无 荚 膜 ， 革 兰 氏 染 色 阳 性 。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 营养 要 求 不 高 ， 在 普 通 培 养 基 上 生 长 良 好 ， 需 氧 或 兼 性 厌 氧 ， 最 适 生 长 温 度 37C， 最适 生 长 pH7.4,干 燥 环 境 下 可 存 活 数 周 。 平 板 上

14、 菌 落 厚 、 有 光 泽 、 圆 形 凸 起 ， 直 径12mm。 血 平 板 菌 落 周 围 形 成 透 明 的 溶 血 环 。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 有 高 度 的 耐 盐 性 ， 可 在1015%NaCl 肉 汤 中 生 长 。 可 分 解 葡 萄 糖 、 麦 芽 糖 、 乳 糖 、 蔗 糖 ， 产 酸 不 产 气 。 甲基 红 反 应 阳 性 ， VP 反 应 弱 阳 性 。 许 多 菌 株 可 分 解 精 氨 酸 ， 水 解 尿 素 ， 还 原 硝 酸 盐 ，液 化 明 胶 。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 具 有 较 强 的 抵 抗 力 ， 对 磺 胺 类 药 物 敏 感

15、性 低 ， 但 对 青 霉 素 、红 霉 素 等 高 度 敏 感 。 对 碱 性 染 料 敏 感 ， 十 万 分 之 一 的 龙 胆 紫 液 即 可 抑 制 其 生 长 。耐药性 (resistance)是微生物对抗菌药物的相对抗性，是微生物进化过程的自然界规律，也是微生物耐药基因长期进化的必然结果。由于抗菌药物杀死了敏感菌群，而对耐药菌的存活和繁殖无效，所以耐药性是过度使用和滥用抗菌药的必然后果。 当前，耐药菌的产生和蔓延已经成为世界性问题。如肺炎、结核病和疟疾等，由于其微生物对许多现有药物产生了耐药性而变得越来越难以治疗。耐药性是如何形成和发展的？如何遏制这一威胁？已经成为全球关注的热点问

16、题。 1 耐药性的类型 耐药性分为：天然耐药性、获得耐药性、多重耐药性以及交叉耐药性1 。 天然耐药性 ，又称原发性耐药性，遗传性耐药性,内源性耐药性,它决定抗菌谱。如全部肠杆菌科细菌对大环内酯类、克林霉素、利萘唑酮、奎奴普丁和莫匹罗星；鲍曼不动杆菌对氨苄西林、阿莫西林和第一代头孢菌素；铜绿假单胞菌对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、第一、二代头孢菌素、头孢噻肟、头孢曲松、萘啶酸和甲氧嘧啶；肺炎链球菌对甲氧嘧啶和氨基糖苷类；嗜麦芽窄食单孢菌对亚胺培南；沙雷菌属对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克 拉维酸、第一代头孢菌素、头孢呋辛和多黏菌素 E 均属天然耐药。天然耐药性是某种细菌固有的特点，其原因可能是此类细菌具有天然屏障，药物无法进入细菌体内或由于细菌缺少对药物敏感的靶位所至。 获得性耐药性 是在微生物接触抗菌药物后,由于遗传基因的变化、生存代谢途径的改变而产生的耐药性。获得性耐药性可分为相对耐药性(又称中间耐药性) 和绝对耐药性(又称高