酶工程复习资料(整理)

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1、第一章：（一）酶工程的概念 是将酶、细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术 一、酶的分类 1.氧化还原酶：2.转移酶：3.水解酶：4.裂合酶：5.异构酶 6.连接酶，7. 核酶（一）酶的组成形式1.单体酶( monomeric enzyme) ：由一条或多条肽链组成，肽链间以共价键结合的酶。2 .寡聚酶(oligomeric enzyme) ：由若干相同或不相同的亚基以非共价键结合而组成，亚基一般没有活性，必须相互结合后才有活性。3.多酶复合体(multienzyme system) ：由 2 个或

2、 2 个以上功能相关的酶通过非共价键连接而成的、能进行连续反应的体系就是多酶复合体。（二）酶的结构特点(holoenzyme) （apoenzyme） (cofactor) 全 酶 = 酶蛋白 + 辅因子（金属离子、辅酶、辅基）金属离子无机离子 金属离子有机化合物辅酶、辅基 辅酶(coenzyme) ：指与酶蛋白结合比较松弛的小分子有机物质，通过透析方法可以除去。例如硫胺素、焦磷酸。 辅基(prosthetic group) ：是以共价键和酶蛋白结合，结合的较紧密，不能通过透析法除去，需要经过一定的化学处理才能与酶蛋白分开。四、酶的作用机制（一）酶的结构组成及活性中心 调控基团 中心外必需基团

3、酶的结构 必需基团 活性中心 结合部位 中心内必需基团催化部位 活性中心以外的必需基团 其它部分1、酶的活性中心(active center) ：是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。2、结合部位：酶分子中与底物结合，使底物与酶的一定构象形成复合物的基团。酶的结合基团决定酶反应的专一性。3、催化部位：酶分子中催化底物发生化学反应并将其转变为产物的基团。4、 4、调控基团：酶分子中一些可与其他分子发生某种程度的结合并引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用的基团催化基团决定酶所催化反应的性质，同时也是决定反应的高效性。（二）酶作用专一性机理 专一性

4、：一种酶只能作用于一种或一类底物。表现为1.锁钥模型认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶活性部位的形状与所需作用的底物形状相吻合，它们可以象钥匙与锁一样互相匹配。此学说可以较好的解释酶的立体异构专一性；但不能解释酶的多底物现象、酶对正反方向的催化等2.诱导契合模型该学说认为酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合的过程中，由于酶与底物相互诱导，使底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这个动态的辨认过程称为诱导契合。（三）酶作用高效性机理 中间产物学说（过渡态学说（四）影响酶高效性的因素1. 邻近定向效应 2. 变形或张力 3. 广义的酸碱

5、催化4. 共价催化（亲核催化/亲电催化）5. 酶的活性中心为疏水区域第三节 酶的催化特点和影响因素一、酶的催化特点（一）高催化效率（二）强专一性（三）可调节性（四）活性的不稳定性二、影响酶活力的因素（一）底物浓度（二）产物浓度 正反馈调节：反应的中间产物或终产物能够起激活变构剂的作用，使酶促反应速率加快。 负反馈调节：反应的中间产物或终产物对酶起变构抑制作用，使酶促反应速率降低（三）酶浓度 在一定条件下酶促反应的速度与酶的浓度成正比。当底物浓度达到饱和时，增加酶的浓度可增加反应速度，酶促反应的速度与酶的浓度成正比关系。（四）温度 最适温度（optimum temperature）：使酶促反应速

6、度达最大时的温度。（五）pH六、抑制剂抑制作用：通过与酶分子上的某些必需基团结合，使这些基团的结构和性质发生改变，从而引起酶活力下降或丧失，这种作用称为抑制作用。变性作用：变性剂（七）激活剂（1）无机离子：金属离子（K+ Na+ Mg2+ Zn2+ Fe2+ Ca2+） 、阴离子（Cl- Br-） 、氢离子（2）小分子有机化合物：某些还原剂、乙二胺四乙酸（EDTA）（3）生物大分子（主要是激活酶原）无活性的酶原 有活性的酶 第四节 酶的活力测定酶活力：也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性关系。所以测定酶的活力就是测定

7、酶的反应速率酶反应速率：用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。单位：浓度/单位时间酶的比活力代表酶的纯度，用每 mg 蛋白质所含的酶活力单位数表示，对同一酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。1、米氏常数 Km ：当 v=1/2 Vmax 时的底物浓度 Km 值：是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是 mol/L，与底物浓度的单位一样。 高 Km 值弱底物结合（k2k1） 低 Km 值强底物结合（k2k1）（3）不同的酶具有不同 Km 值，它是酶的一个重要的特征物理常数，只与酶的性质有关，而与其浓度无关。（4）Km 值只是在固定的底物，一定的温度和 p

8、H 条件下，一定的缓冲体系中测定得到的，不同条件下具有不同的 Km 值。（5）同一种酶有几种底物就有几个 Km 值，其中 Km 值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。1）不可逆抑制作用 专一性不可逆抑制作用非专一性不可逆抑制作用2）可逆抑制作用 竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制三种可逆抑制作用的比较抑制剂结构抑制剂结合位点酶的结合能力增加底物浓度的影响Km可逆竞争性抑制与底物近似酶的活性部位不能同时结合底物和抑制剂解除抑制效应增加可逆非竞争性抑制与底物不同活性部位外的其他位点同时结合两者无影响 不变可逆反竞争性抑制与底物不同活性部位外的其他位点与底物结合后才与抑制剂结合无影响 变小第

9、二章 酶的发酵工程二、酶生物合成的诱导作用 诱导酶：细胞在外来底物或底物类似物诱导下合成的。 组成酶：细胞所固有的酶，在相应的基因控制下合成，不依赖底物或底物类似物而存在。诱导可分为 协同诱导：诱导物同时或几乎同时诱导几种酶的合成。 顺序诱导：先后诱导合成分解底物的酶和分解其后各中间代谢产物的酶。三、酶生物合成的阻遏作用 终产物阻遏：由于终产物的过量积累而导致的生物合成途径中酶合成的阻遏。 分解代谢物阻遏：大肠杆菌在含有能分解的两种底物（葡萄糖和乳糖）的培养基中生长时，首先分解利用葡萄糖，而不分解乳糖，这是因为葡萄糖的分解代谢产物阻遏了分解利用乳糖的有关酶的合成。这种阻遏称为分解代谢物阻遏，或

10、葡萄糖效应。第二节 酶的发酵技术（三）产酶菌的获得1、菌种的采集 （1）胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件接近。（2）要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。（3）如果预先不了解产酶菌的来源，一般可以从土壤中分离，因为土壤是微生物的大本营。 2、富集培养（1）原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选3、菌种的分离纯化例如：筛选能产生水解酶的菌株以该酶的底物作为培养基中的主要碳源或氮源，如果菌株能产生所需要的酶，经过一定时间培养后就能分解周围的底物，从而在菌落周围形成一个透明的水解圈。

11、如果透明圈不明显，可在培养结束时加入底物的沉淀剂（或显色剂） ，使未被分解的底物显现出来，从而更清晰的衬托透明圈。4、产酶性能测定通常是将平板分离出来的产酶能力较强的菌株转入三角瓶内振荡培养，然后用生产上常规的测定方法对培养产物进行分析鉴定，从中找出产酶量高、性能更符合要求的菌株。5、菌种的退化与复壮三、发酵方法 液体深层发酵 固体发酵 分批发酵 连续发酵 补料分批发酵 四、提高产酶的措施（一）通过条件控制提高酶产量（二）通过基因突变提高酶产量（三）通过基因工程提高酶第三节 酶的发酵动力学 同步合成型 延续合成型 中期合成型 滞后合成型第三章 酶的分离工程第一节 预处理目的：1、改变发酵液的过

12、滤特性：如降低液体黏度（加水稀释、加热、酶解） ，凝聚与絮凝，调整发酵液 pH，加助滤剂等。2、去除发酵液中的部分杂质：如杂蛋白、无机金属离子、色素等。第二节 固液分离1、过滤分离法 低速离心（常速离心）：8000 r/min高速离心：1000025000 r/min，常带冷冻超速离心： 25000120000 r/min 差速离心：低速与高速离心交替进行，使两种以上沉降系数不同的颗粒先后沉淀，从而实现分批分离的方法。 密度梯度离心：是指将样品在密度梯度介质中进行离心，从而使沉降系数很接近的颗粒分离开来的方法。P45 图 3-1 等密度梯度离心：3、超滤A、微孔过滤：操作压为 0.050.5

13、MPa，膜的平均孔径为 0.0510m。B、超滤：操作压在 0.111.0 MPa，膜的平均孔径为 0.0010.05m。C、反渗透：操作压达到 110 MPa，膜的平均孔径为 0.11nm 。4、电渗析第三节 细胞的破碎1、机械破碎法：捣碎法、研磨法、匀浆法2、物理破碎法：温差法、压差法、超声波法3、化学破碎法：有机溶剂（甲苯、丙酮等） 、表面活性剂（吐温等）4、酶促破碎法第四节 酶的分离纯化1、分子大小不同（1）离心（Centrifugation） （2）透析（3）凝胶过滤（Gel filtration） （4）超滤（Ultrafiltration）2、分子电荷不同（1）等电聚焦电泳（IF

14、E） （Isoelectric focusing electrophoresis） （2）离子交换层析（Ion exchange chromatography）3、分子极性不同（溶解度不同）(1) 盐析（Salting-out）(2) 等电点沉淀(3) 有机溶剂沉淀(4) 萃取4、亲和力不同亲和层析：利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术。第四节 酶的分离纯化1、离心2、沉淀（1）盐析沉淀法（2）等电点沉淀法（3）有机溶剂沉淀法（4）选择性变性沉淀法（5）其它3、过滤与膜分离 粗滤：截留物质直径2m，压差 微滤：截留物质直径0.22m，压差 超滤：截留物质直

15、径 2nm0.2m 压差 透析：浓度差4、萃取5、色谱法（层析分离）凝胶色谱 离子交换色谱 亲和色谱 高效液相色谱 疏水层析 吸附层析等6、电泳 纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等点聚焦电泳、双向电泳。第五节 酶的浓缩、干燥与结晶一、酶的浓缩 ：蒸发浓缩 超滤浓缩 胶过滤浓缩 反复冻融浓缩 聚乙二醇浓缩二、酶的干燥：1、真空干燥 2、喷雾干燥 3、冷冻干燥 4、气流干燥 5、吸附干燥：硅胶、无水氯化钙等第四章 固定化酶与固定化细胞第二节 酶的固定化一、固定化酶的定义Immobilized enzyme：借助物理或化学的方法，将酶固定于水不溶性或水溶性载体而制成的一种酶制剂形式，它能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。三、酶的固定化方法1.吸附法：利用氢键、疏水作用、离子键等作用，将酶固定在水不溶载体表面的固定化方法。 2.共价结合法：载体与酶分子之间通过共价键作用而结合，是利用最多的固定化方法之一。3.交联法：用双功能或多功能试剂使酶分子之间、酶分子与惰性蛋白之间，酶分子与载体之间进行交联反应，形成网络结构的固定化方法。4.包埋法：将酶分子截留在具有特定网状结构载体中的固定化方法,只适合作用于小分子底物的酶。5.无载体固定化 各种固定化方法的优缺点比较固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 共价结合法 交联法 包埋法 无载体固定化制备难易 易 易 难