酶工程原理与技术

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1、第一章 绪论酶：具有生物催化功能的生物大分子。 酶工程：酶的生产与应用的技术过程。第一节 酶的基本概念同时酶的催化作用具有：专一性、高效性，作用条件温和等特点第二节 酶的分类与命名按其化学组成不同，酶可以分为主要由蛋白质组成蛋白类酶（P 酶）和主要由核糖核酸组成的核酸类酶（R 酶）两大类别。蛋白类酶和核酸类酶的分类命名的总原则是相同的（根据酶的作用底物和催化反应的类型） ，同时又有所区别一、蛋白类酶的分类与命名推荐名：在惯用名称的基础上，加以选择和修改而成。酶的推荐名一般由两部分组成：第一部分为底物名称，第二部分为催化反应的类型。后面加一个“酶”字（ -ase） 。不管酶催化的反应是正反应还是

2、逆反应，都用同一个名称。系统名称（ Systematic name）：包括了酶的作用底物，酶作用的基团及催化反应的类型。（一）蛋白类酶（P 酶）的分类原则按照酶催化作用的类型，将蛋白类酶分为 6 大类。第 1 大类，氧化还原酶 第 2 大类，转移酶 第 3 大类，水解酶 第 4 大类，裂合酶 第 5 大类，异构酶 第 6 大类，合成酶（或称连接酶）每个大类中，按照酶作用的底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类。每一亚类中再分为若干小类。每一小类中包含若干个具体的酶六大类蛋白类酶简介1、氧化还原酶（ Oxidoreductases）催化氧化还原反应，其催化反应通式为：AH 2 + B A +BH

3、 22、转移酶（Transferases）反应通式为：AB + C A + BC3、水解酶 (Hydrolases)催化各种化合物进行水解反应的酶称为水解酶。其反应通式为： AB H 2O AOH BH4、裂合酶 (Lyases)催化一个化合物裂解成为两个较小的化合物及其逆反应的酶成为裂合酶。其反应通式为：AB A B 乙酰乳酸合酶（ 2-乙酰乳酸 CO2 2-丙酮酸）5、异构酶 (Isomerases)催化分子内部基团位置或构象的转换的酶称为异构酶其反应通式为： AB。异构酶按照异构化的类型不同，分为 6 个亚类。命名时分别在底物名称的后面加上异构酶（isomerase） 、消旋酶（race

4、mase） 、变位酶（mutase） 、表异构酶（epimerase） 、顺反异构酶（cis-trans-isomerase）等。6、连接酶(Ligases) 或合成酶(Synthetases) 连接酶是伴随着 ATP 等核苷三磷酸的水解，催化两个分子进行连接反应的酶。其反应通式为： A + B + ATP AB + ADP + Pi 或 AB +AMP +PPiR 酶采用的分类原则：根据酶作用的底物是其本身 RNA 分子还是其它分子，将核酸类酶分为分子内催化（in cis）R 酶和分子间催化（in trans）R 酶两大类。在每个大类中，根据酶的催化类型不同，将 R 酶分为若干亚类。如剪切酶

5、，剪接酶，多功能酶等可将分子内催化的 R 酶分为自我剪切酶（Self-cleavage）自我剪接酶（Self-splicing）等亚类分子间催化的 R 酶可以分为 RNA 剪切酶，DNA 剪切酶，多肽剪切酶，多糖剪接酶等亚类。在每个亚类中，根据酶的结构特点和催化特性的不同，分为若干小类。第三节 酶活力的测定酶活力（enzyme activity）的大小可以用一定条件下酶所催化的反应初速度表示。在外界条件相同的情况下，反应初速度越大，酶的活力越高。一、酶活力测定方法酶活力测定的方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法等。酶活力测定的要求：快速、简便、准确。酶活力测定的步骤：(1)根据酶催化的专一

6、性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。(2)根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH 值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。(3)在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。(4) 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。注意：若不能即时测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。终止酶反应的方法：（1）加热使酶失活 （2）加入适宜的酶变性剂（如三氯醋酸） ；（3）调节 pH 值；（4）低温终止反应。 二、酶活力单位在特定条件下，每 1 min 催化 1 mol 的底物转化为产物的酶量定义为 1 个酶活

7、力单位。这个单位称为国际单位（IU）国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（Kat） 。在特定条件下，每秒催化 1 mol 底物转化为产物的酶量定义为 1 卡特（Kat） 1Kat = 610 7 IU 酶的比活力是酶纯度的一个指标，是指在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或 RNA 所具有的酶活力单位数。 酶比活力酶活力（单位）/ mg （蛋白或 RNA）三、酶的转换数与催化周期酶的转换数（Kp） ，又称为摩尔催化活性（molar catalytic activity ） ，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即是每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。Kp 是酶催化效率的一个指标。通常

8、用每微摩尔酶的酶活力单位数表示。单位为 min -1 转换数的倒数称为酶的催化周期。催化周期是指酶进行一次催化所需的时间。单位为毫秒（msec）或微秒（sec） 。 四、固定化酶的活力测定(4) 固定化酶的比活力测定：在固定化酶中，一般采用每克（g）干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。即：比活力= 酶活力单位/ cm 2（5）酶结合效率与酶活力回收率的测定酶结合效率又称为酶的固定化率，是指酶与载体结合的百分率。酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。（6）相对酶活力的测定 具有相同酶蛋白（或酶 RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。酶在应用过程中也表

9、现出一些不尽人意之处:活力不高 稳定性差 分离纯化困难第二章 酶生物合成的基本理论 酶的生产方法 1、提取分离法 定义：采用各种技术从动植物或微生物细胞中将酶提取出来，再与所含杂质进行分离的技术过程。 优点：设备简单，操作方便 缺点：原料的周期长，来源有限，并受地理气候和季节等因素的影响，受经济、技术及伦理各方面的限制。 2、生物合成法：最广泛使用的方法 定义：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞、动植物细胞的生命活动而获得人们所需酶的技术过程。 分类：微生物发酵产酶（应用最广） 、植物细胞培养产酶、动物细胞培养产酶 优点：生产周期短，酶的产率高，不受生物资源、地理环境和气候条件等影响。

10、 缺点：对发酵设备和工艺条件要求高。 3、化学合成法 定义：按照酶的化学结构中氨基酸或核苷酸的排列顺序，通 过化学反应将一个一个的单体（氨基酸或核苷酸）连接起来而获得所需酶的技术过程。 缺点：反应步骤多，只适于短肽，受试剂、设备和成本等因素限制。 只合成化学结构十分清楚的少数酶 转录的基本过程：（转入的起始、RNA 链的延伸和 RNA 链合成的终止） 转录以 DNA 为模板，以核苷三磷酸为底物，在 RNA 聚合酶（转录酶）的作用下，生成 RNA 分子的过程。转录过程的特点 转录的不对称性：在 RNA 的合成中，DNA 的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。 （反义链，有义链

11、） 反义链 antisense strand（无意义链，负链）：在 RNA 的转录中，用作模板的 DNA 链称为反义链。 有义链 coding strand（编码链，正链）：在 RNA 的转录中，不作为模板的 DNA 链称为有义链。 转录所需酶：依赖 DNA 的 RNA 聚合酶又称为转录酶，是以 DNA 为模板的一类 RNA 聚合酶。 原核生物：核心酶，全酶（核心酶 + 因子） 。 真核生物：RNA 聚合酶、RNA 聚合酶和 RNA 聚合酶，都属于寡聚酶，酶的亚基数目为 410 个，亚基种类有 46种。 转录过程 起始位点的识别 recognition 转录起始 initiation 链的延伸

12、 elongation 转录终止 termination 转录后加工 modification 蛋白质的合成过程（P25） 酶生物合成的调节（P29） 适应酶：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。 通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。 酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含 量，从而对各种生物化学过程进行调控。 酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。 DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转

13、录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。 分解代谢物阻遏作用 （原核生物酶简述分解代谢物阻遏作用的原理及解除方法） 分解代谢物阻遏作用是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。 原理：酶生物合成的诱导作用 （什么是酶合成的诱导作用？其原理是什么？） 酶生物合成的诱导作用是指加入某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象。 原理？ 酶生物合成的反馈阻遏作用 （什么是酶生物合成的反馈阻遏作用？其原理？） 酶生物合成的反馈阻遏作用有称为产物阻遏作用，是指酶催化反

14、应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。 原理？ 端粒酶(P33)是催化端粒合成和延伸的酶。端粒酶是一种核糖核蛋白，包含蛋白质和 RNA 两种基本成分。 抗体酶（P34）又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。 第三章 酶的生物合成法生产第一节 细胞的选择酶生产的细胞必须具备的条件：1、酶的产量高 2、容易培养和管理 3、产酶稳定性好 4、利于酶的分离纯化5、安全无毒微生物的基本要求1 不是致病菌 2 发酵周期短,产酶量高 3 不易变异退化 4 最好是产生胞外酶的菌种,利于分离 5 对医药和食品用酶,还应考虑安全性： 6 由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验

15、。7 非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。第二节 培养基的配制一、培养基的基本成分1、碳源大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物，如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。植物细胞以蔗糖为碳源；动物细胞以谷氨酰胺或谷氨酸为碳源 2、氮源：有机氮源和无机氮源两大类。不同的细胞对氮源有不同的要求：动物细胞要求有机氮源；植物细胞主要使用无机氮源；微生物细胞中，异养型细胞要求有机氮源 自养型细胞采用无机氮源在使用无机氮源时要注意铵盐和硝酸盐的比例碳和氮两者的比例，即碳氮比（C/N） ，对酶的产量有显著影响。所谓碳氮比一般是指培养基中碳元素（C）的总量与氮元素（N）总量之比。培养

16、基的设计原则1、选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适 3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心设计、试验比较三、植物细胞培养基1、植物细胞培养基的特点（1）植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐（2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。（3）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源（4）植物细胞一般以蔗糖为碳源2、常用的植物细胞培养基MS 培养基：硝酸盐浓度高，广泛应用于植物细胞、组织和原生质体培养B5 培养基：铵盐浓度低，适于双子叶植物特别是木本植物的组织、细胞培养White 培养基：无机盐浓度低，适合生根培养KM-8P 培养基：有机成分种类全面，广泛应用与原生质体的培养（一）动物细胞培养基的组分1 氨基酸：必需氨基酸、谷氨酰胺、谷氨酸 2 维生素：无血清需补充 VB