酶工程重点(南林大)

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1、1合。酶工程重点1.酶催化作用的特点 （1）只能进行热力学上允许进行的反应；（2）可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡；（3）通过降低活化能加快化学反应速度。 * 活化能：在一定浓度下， 1mol 底物全部进入活化态所需要的自由能（ kg/mol）2.米氏方程的推导酶促反应：（1）酶与底物作用，形成酶-底物复合物：E + S ES 1kA（2）酶-底物复合物分解形成产物，释放出游离酶：ES E + P2 推导：（1）根据“中间产物学说”得: ES2kv（2）根据“拟稳态学说”得： 0)(,0 21-1 SEkdtES即变式得： 1-k）（令： 则：12-kKm SKEESm）（故

2、 2ESvm由于反应系统中：SE，当S很高时所有酶都被底物所饱和形成 ES，即E=ES,酶促反应达到最大速率： 22axkSV最终得： 米氏方程maxSKv3.米氏常数的测定和意义（1）测定：（基本原则）将米氏方程变化成相当于 y=ax+b 的直线方程，再用作图法求Km.双倒数作图法： maxax11VSv（2）意义：当 v=Vmax/2 时，Km=S （Km 单位 mol/L）是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定 Km 的值，可鉴别酶。可近似表示酶和底物亲和力：Km 愈小，E 对 S 的亲和力愈大； Km 愈大，E 对 S 的亲和力愈小。4.可逆抑制的种类和判别（1）竞争性抑制：某些抑制

3、剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结Vmax 不变，Km 变大，酶促反应速度减小（2）非竞争性抑制：酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。 （I 可以与 E 结合，也可与 ES 结合，同样几率。 ）Vmax 减小，Km 不变，酶促反应速度下降（3）反竞争性抑制：Vmax 减小，Km 变小* 考试题型：1、选择 2、填空 3、名词解释 4、简答 5、论述2（浓度/时间）仅能与酶底物复合物结合，但 ESI 不能转化为产物 P5.酶的分类和命名（1）分类：氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 连接酶（2）命名：系统名：包括所有底物的名称和反应类型。

4、推荐名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。氧化还原酶：AH2+B=A+BH2 被氧化的底物（AH2）为氢或电子供体，被还原的底物（ B）为氢或电子受体。系统命名时，将供体写在前面，受体写在后面，然后再加上氧化还原酶字。主要包括脱氢酶和氧化酶。转移酶：AB+C=A+BC 系统命名：“供体：受体某基团转移酶” 。 推荐名：“受体（或供体）某基团转移酶”。水解酶：水解酶催化底物的加水分解反应。系统命名：先写底物名称，再写发生水解作用的化学键位置，后面加上“水解酶” 。 推荐名：在底物名称的后面加上个酶字。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及酯酶等。裂合酶：催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反

5、应及其逆反应。系统命名：“底物-裂解的基团 -裂合酶”推荐名：在裂解底物名称后面加上“脱羧酶” 、 “醛缩酶” 、 “脱水酶”等。在缩合反应方向更为重要时，则用“合酶” 。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶。异构酶：催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。按照异构化的类型不同，分为 6 个亚类。命名时分别在底物名称的后面加上异构酶、消旋酶、变位酶、表异构酶、顺反异构酶等。连接酶（合成酶）：A+B+ATP+H-O-H=A-B+ADP+Pi能够催化 C-C,C-O,C-N 以及 C-S 键的形成反应，这类反应必须与 ATP 分解反应相互偶联。系统命名：在两个底物的名称后面加上“

6、连接酶”推荐名：在合成产物名称后加上“合成酶” 。6.酶活力的单位和酶活测定步骤（1）酶活力的单位 U：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。国际酶活力单位 IU：在最适条件下，每分钟内催化 1um ol 底物转化为产物所需的酶量。1972 年定位 1kat 单位：每秒钟能催化 1mol 底物转化为产物所需的酶量。1kat=60106IU（2）酶活力测定步骤根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成溶液。根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH 值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，反应时间。3对需要辅酶的酶来说，辅

7、酶分子或辅酶分子上的某一部分结构，往往也是酶活性部分的组成部分。运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。注意：若不能即时测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。7.酶活性中心的定义和部位（1）定义：特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域。（2）部位： 结合部位：负责与底物的结合，决定酶的专一性。催化部位：负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力。8.影响酶催化效率的有关因素（1）底物和酶的邻近与定向效应：分子间反应变为分子内反应的过程邻近效应：指酶与底物结合形成中间复合物后，使底物和底物（如分子反应）之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度

8、得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种效应。定向效应：指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。（2）底物的形变和诱导契合（3）酸碱催化：是通过瞬间向反应物提供质子或从反应物接受质子的稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。酶分子中可以作为广义酸（质子供体） 、碱（质子受体）的基团。* His 是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。（4）共价催化：又称亲核催化或亲电子催化在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。 （5）金属离子催化需要金属

9、的酶分类：1）金酸酶 2）金属-激活酶金属离子以 3 种主要途径参加催化过程：1）通过结合底物为反应定向2）通过可逆的改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应3）通过静电稳定或屏蔽负电荷（6）多元催化和协同效应（7）活性部位微环境的影响9.简述胰凝乳蛋白酶的催化反应机制胰凝乳蛋白酶能选择裂解芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸羧基侧链。其活性中心有丝氨酸 195、组氨酸 57、天冬氨酸 102 组成。在胰凝乳蛋白酶的催化反应中，组氨酸的咪唑基起着广义酸碱催化剂的作用。先促使丝氨酸 195 的羟基亲核地附着到底物敏感肽键中的羧基原子上，形成共价的酰化中间物，再促进酰化的 ES 中间物上的酰基转移到水或其

10、他的酰基受体（如醇、氨基酸等）上。10.酶活性的调节控制（1）调节酶的浓度（2）通过激素调节酶活性（3）反馈抑制调节酶活性：在多酶体系中，反应的总速度决定于其中反应速度最慢的一个反应，称为限速步骤。它受到终产物的反馈抑制。4mgUg总 蛋 白总 活 力酶 活 力比 活 力 Pr（4）抑制剂和激活剂对酶活性的调节（5）其他调节方式：別构调节，酶原的调节，酶的可逆共价修饰和同工酶来调节酶的活性。11.名词解释（1）协同效应：一个配体与蛋白或酶结合对后续同种或同类配体结合的影响。（2）同工酶：指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构，理化性质和免疫性能等方面 都存在明显差异的一组酶。（3）酶活力单位

11、：见上 6（4）比活力：用每 mg 蛋白质所含酶活力单位数，比活愈大，纯度愈高。（5）催化转换数：又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即是每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。是酶催化效率的一个指标。通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示。单位为 min-1 。）酶 微 摩 尔 数 （ ）酶 活 力 单 位 数 （）分 钟 （酶 摩 尔 数 ）底 物 转 变 摩 尔 量 （ molIUKp minol（6） （酶的）固定化率：又称为酶结合效率，是指酶与载体结合的百分率。加 入 的 总 酶 活 力未 结 合 的 酶 活 力加 入 的 总 酶 活 力酶 结 合 效 率 -

12、（7） （酶）活力回收率：指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。%10用 于 固 定 化 的 总 酶 活 力固 定 化 酶 总 活 力酶 活 力 回 收 率12.名词解释（1）酶的发酵生产:经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。（2）酶的诱导:是指加入某些物质使酶的生物合成开始或加速的现象。 （乳糖操纵子)（3）酶的反馈阻遏（产物阻遏）:是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使酶的生物合成受到阻遏的现象。 （色氨酸操纵子)（4）分解代谢阻遏:是指某些物质（主要是指葡萄糖和其它容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物

13、合成的现象。 （细菌对乳糖和葡萄糖的选择)（5）诱导的种类:组成酶：细胞固有的酶类诱导酶：细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的一类酶。（6）组成酶：生物细胞中合成的酶的量比较恒定，这些酶的合成速率影响不大。如 DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。（7）适应酶：生物细胞中合成的酶的含量却变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌 -半乳糖苷酶。13.酶的生产方法。P20（1）提取分离法：采用各种提取、分离、纯化技术从动物、植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来，再进行分离纯化的技术过程。酶的提取：是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含有酶原料，使酶充

14、分溶解到溶剂中过程。主要提取方法有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。酶的分离纯化：采用各种生化分离技术，如离心分离、过滤和膜分离、萃取分离、沉淀5（2）一般工艺流程：保藏菌种试管斜面培养（活化）摇瓶扩大培养种子罐培养（培养基）发酵罐（无菌空气）分离纯化酶分离、层析分离、电泳分离、以及浓缩、结晶、干燥等，使酶与各种杂质分离，达到所需的纯度，以满足使用的要求。（2）生物合成法：成为酶的主要生产方法。根据所使用的细胞种类不同，生物合成法可以分为微生物发酵产酶、植物细胞培养产酶和动物细胞培养产酶。 （填）（3）化学合成法14.酶的发酵生产的定义和微生物发酵产酶的一般工艺流程。（1）酶

15、的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。15.原核生物中酶生物合成调节机制 原核生物中的酶生物合成的调节主要是转录水平的调节，又称基因的调节（操纵子学说）。转录水平的调节主要有 3 个模式：（1）分解代谢物阻遏作用：细胞内同时有 2 种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏与利用慢的底物的分解有关的酶的合成现象。（2）酶合成的诱导作用：加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。（3）酶合成的反馈（末端产物）阻遏作用：由某代谢途径末端产物的过量积累引起的阻遏。* 操纵子：是基因表达和控制的一个完整单元，其中包括结构基因、调节基因、操

16、纵基因和启动基因。16.常见产酶微生物有哪些？（1）细菌：大肠杆菌、枯草杆菌（2）放线菌：链霉菌（3）霉菌：黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根酶、毛霉等（4）酵母菌：啤酒酵母、假丝酵母17.微生物产酶模式有几种？特点？最理想的合成模式是什么？P37（1）同步合成型：特点：生物合成可以诱导，但不受分解代谢阻遏物和反应产物阻遏酶所对应的 mRNA 很不稳定大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。（2）延续合成型：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。特点：生物合成可以诱导，但不受分解代谢阻遏物和反应产物阻遏酶所对应的 mRNA 很不稳定（3）中期合成型