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1、1骨组织工程种子细胞骨髓间充质干细胞研究进展【关键词】 子细胞 【摘要 】 目的 综述近年来骨髓间充质干细胞体外培养、定向分化为成骨细胞的条件及相关研究进展。方法 查阅大量相关文献，整理、综合、分析骨髓间充质干细胞的研究进展。结果 骨髓间充质干细胞具有增殖和分化潜能，在特定条件下可定向分化为成骨细胞，目前倾向于多因素联合应用或序贯使用促进骨髓间充质细胞高效表达成骨标志产物，提高成骨率。结论 骨髓间充质干细胞可满足骨组织工程中种子细胞的要求，具有广阔的发展前景和临床应用价值。关键词 组织工程 骨髓间充质干细胞 成骨骨组织工程学研究内容包括种子细胞、载体、诱导物质以及组织工程化骨组织的临床应用等诸
2、多方面，其中种子细胞是组织工程研究中首要的、最基本的环节。20 世纪 70 年代中期 1 就已证实骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）具有自我增殖能力和分化潜能，而且 BMMSCs具有来源广泛、取材简单、分化成骨潜能强等特点，成为目前骨组织工程种子细胞研究的重点。21 骨髓间充质干细胞体外培养研究进展干细胞是指那些具有高度增殖和自我更新能力，并能分化为两种以上不同类型组织细胞的细胞;组织干细胞是指发育成熟的个体内具有多向分化潜能的细胞，目前比较明确的能够转化的组织干细胞主要是骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenc
3、hymal stem cells，BMMSCs） 。Freidenstein 1 发现了骨髓培养中有呈纺锤状的少量贴壁细胞，能够分化形成多种中胚层组织，包括:骨、软骨、肌腱、肌肉组织、骨髓基质结缔组织等，这种形成集落的初始骨髓基质细胞被称为成纤维细胞样细胞集落形成单位（Colony forming unit-firbroblastic，CFU-F） 。Mingnell 2 认为BMMSCs 为存在于骨髓基质中的非造血来源的细胞亚群， Ashton 3 称其为骨髓基质成纤维细胞。BMMSCs 对营养条件要求高，而且含量很低，约为 0.001%0.01%，要利用 BMMSCs 就必需实现其体外分离
4、培养及扩增 4 。BMMSCs 培养方法主要有全骨髓培养法和离心培养法，前者是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于 BMMSCs的贴壁生长，可采用 DMEN 和胎牛血清。胎牛血清终浓度为10%20%，塑料培养瓶较一般玻璃培养瓶更有利于 BMMSCs 贴壁生长。有人主张用 4%醋酸溶解 RBC，去除 RBC 对 BMMSCs 的3贴壁干扰，但有人认为 RBC 会随着换液而逐渐被自然去除，对BMMSCs 影响不大。细胞融合后以 1:2 比例传代，34 天换液一次 5 。离心培养法是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无
5、菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释，以 15002000r/min 离心 2030min，采集交界处的单核细胞层，PBS 洗涤 23 次后，加入培养液接种培养。机体内 BMMSC 数量很少，接种数目太少会影响成骨率，太多对于临床应用又不太现实，每立方厘米载体接种 110 6 个细胞就能满足成骨要求。目前，三维细胞培养技术已在骨组织工程中得到广泛应用，Kinoshita 6 等利用胶原凝胶载体培养 BMMSCs，发现三维的胶原网络能有效的刺激成骨细胞分化;Glowacki 7 等采用培养液灌注造成动力性三维细胞培养环境，增加了细胞的适应生存能力及成骨功能。三维细胞培养能够有效地种植功能细胞、保持
6、旺盛的细胞活性、最大程度地发挥细胞的功能。特别是流体力学刺激可通过 PGE 2 途径将力学刺激转导至细胞内发挥调节作用，能够明显增加成骨细胞增殖，总蛋白合成和 DNA 合成增加 8 。2 骨髓间充质干细胞定向分化的研究进展4特定条件下，组织干细胞才能向成骨细胞转化，骨髓间充质干细胞成骨很大程度上依赖于体外培养条件，而且，BMMSCs 的定向分化还受到其他多种条件的制约和影响。体外细胞的分化程度决定着成骨的成败，加入成骨诱导剂可促使 BMMSCs 向成骨细胞分化。化学物质（如 Dex、1 ，25（OH ） 2 D 3 、-GP、维生素 C 等） ，细胞因子（如 BMP、TGF-、bFGF 等）可
7、促进 BMMSCs 成骨过程中标志产物 ALP、BGP、骨桥蛋白、骨涎蛋白等高效表达及矿化结节形成，提高成骨率。迄今为止，对这些诱导物的作用机制知之甚少，而且不同诱导剂的作用又不尽相同 911 。大量实验研究发现:Dex 作用于 BMMSCs 后，骨髓间充质干细胞ALP 活性增强，骨钙素（BGP） 、骨涎蛋白、骨桥蛋白的合成明显增加。Dex 可促进 BMMSCs 的成骨分化，早期以促进基质合成为主，后期以促进矿化为主。Dex 促进成骨的同时，亦诱导细胞向脂肪分化。Beresford 10 在传代培养细胞中加入 1，25（OH） 2 D 3 ，则抑制其向脂肪细胞转化，骨钙蛋白 mRNA 表达增加
8、，证实向成骨细胞转化占优势，而仅在传代培养细胞中加入 Dex 时，则多向脂肪细胞转化，这主要是因为 Dex 促进成骨的同时，能激活BMMSCs 表面的糖皮质激素受体，而 1， 25（OH） 2 D 3 通过5降低脂肪细胞晚期基因标志物 ap2 和脂肪的 mRNA 水平而抑制糖皮质激素诱导的脂肪形成 11 。-GP 可释放磷酸根，为细胞矿化提供离子环境，可加速矿化结节的形成和骨钙素的合成。维生素 C 通过延长型胶原转录因子的半衰期而最终增加型胶原mRNA 的含量 9 。BMP、TGF- 、bFGF 等细胞因子在骨髓间充质干细胞分化增殖中起着重要作用，但作用不一 1214 。BMP 为特异性的骨生
9、长因子，靶细胞为血管周围具有分化能力的间充质细胞，能够启动 BMMSCs 的成骨过程，其作用机制:促进 BMMSCs 分化为成骨细胞，引导成骨细胞成骨表型的表达。BMP 为唯一具有异位成骨能力的生长因子，可诱导诱导性骨祖细胞（Inducible osteogenic precursor cell，IOPC）向定向性骨祖细胞（Detenined osteogenic precursor cell，DOPC）分化，这一特征为骨组织工程的临床应用提供了广阔前景。TGF- 是较强的促成骨分化因子，在体内能够增强 BMP 的诱导成骨作用。TGF- 主要是通过促间充质干细胞分裂增殖，为 BMP 提供丰富的
10、靶细胞;抑制脂肪细胞生成;促进骨细胞产生型胶原，抑制软骨细胞产生型胶原，增强基质钙化及对周围的成骨细胞的趋化作用，三方面提高 BMMSCs 的成骨效应。bFGF 是一种促进血管生成剂，在骨移植时可促进局部毛细血管生长。bFGF 能够促进 BMMSCs 体外培养 CFU-F 的形成，6促进细胞增殖。bFGF 可促进 BMMSCs 增殖的同时抑制其向成骨细胞分化;bFGF 对型胶原蛋白的合成有促进增殖作用，而对于型胶原的影响比较复杂，可能 bFGF 是通过与细胞膜上 bFGF 受体结合及一系列信号转导最终激活 DNA-结合蛋白，作用于靶细胞上特异的 bFGF 反应元件起作用。Kypreos 14
11、报道 bFGF 抑制型胶原基因转导可能是由 B-myb 一种 DNA-结合蛋白介导的，bFGF 为具有负性调控作用的细胞因子。Martin 15 研究表明:bFGF 对 BMMSCs 具有最强的促分裂作用，与 BMP-2 联合应用促BMMSCs 转化作用强于应用单一细胞因子。骨的生长代谢是由多种细胞因子、化学物质、物理、生物因素等同时参与调节的过程，目前倾向于多因素联合应用或序贯使用。随着多种骨生长因子调控基因分离成功及成骨机制的分子水平研究的不断深入，基因转移技术广泛用于骨组织工程领域，通过导入标志基因或治疗性基因，可致外源性调节基因表达于修复区，实现诱导成骨、免疫调节或成骨调控等预定目的。
12、经 BMP、TGF- 、潜在性膜蛋白（LMP-1）转染的 BMMSCs 已成功应用于骨组织工程化骨组织的构建和骨缺损的修复 16 。3 问题及展望7近年来关于 BMMSCs 的研究有了较大发展，但将 BMMSCs 应用于临床，仍面临许多问题:（1）BMMSCs 体外定向分化培养尚未探索出成熟的方法，分离纯化细胞群的技术有待进一步提高;（2）BMMSCs 实验仅限于自体移植方面，在异体移植免疫反应问题上有待进一步探索;（3）如何促进 BMMSCs 与载体材料相容生长并成骨的难题有待进一步解决。随着三维细胞培养移植模型的进一步发展、基因转染技术的完善和生物可降解材料的日趋成熟，BMMSCs 移植将
13、有更广阔的前景，骨缺损、骨不连的治疗将进入一个工程化修复重建的崭新领域。参考文献1 Friedenstein AJ.Precursor cells of mechanocytes.Int rev cytol，1976，47:317-334.2 Minbuull JJ， Erices A，Conget P.Mesechymal stem cells.Exp Biol Med， 2001，226 （6）:507-520.83 Ashton BA，Ashhurst DE，Owen ME.The collagens and glycosaminoglycans of bone marrow stromal cells cultured in vivo in diffusion chambers.Orthop Res，1990，8 （5）:741-749.4 Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science，1999，284 （5411 ）:143-147.5 舒胜文，李盛琳，马绪臣. 大白鼠骨髓间质干细胞体外培养体系的建立及分化研究.现代口腔医学杂志，2002，2 （16 ）:97-99.
