《SARS 冠状病毒核衣壳蛋白在酿酒酵母中的表达和纯化 - 实用医学杂志》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SARS 冠状病毒核衣壳蛋白在酿酒酵母中的表达和纯化 - 实用医学杂志（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实 用 医 学 杂 志 !# 年 第 ! 卷 第 !$ 期!%& 基 础 研 究 ()冠 状 病 毒 核 衣 壳 蛋 白 在 酿 酒 酵 母 中的 表 达 和 纯 化杨 雷 张 洪 勤 吴 淑 珍摘 要 目 的 ： 构 建 重 组 表 达 质 粒 *+,#-.， 诱 导 () 冠 状 病 毒 核 衣 壳 蛋 白 （ /0123415*678 *94:37/） 在 酿 酒 酵 母中 的 表 达 和 纯 化 。 方 法 ： 逆 转 录 获 得 () 冠 状 病 毒 ;.( 片 段 ， ?A 中 构 建 重 组 表 达 克 隆 *+,#-.， 在 酿 酒 酵 母 中 诱 导 表 达 并 纯 化 。
2、结 果 ： 重 组 克 隆*B36#-. 经 酶 切 、 测 序 鉴 定 确 定 ， 插 入 片 段 大 小 、 方 向 、 碱 基 匹 配 与 预 期 一 致 ， 获 得 一 个 完 整 的 核 衣 壳 蛋 白 基 因 ， 表 达产 物 纯 化 后 ， 电 泳 鉴 定 ， 相 对 分 子 质 量 近 CD 。 结 论 ： 成 功 克 隆 () 冠 状 病 毒 核 衣 壳 蛋 白 基 因 全 长 ， 并 在 酿 酒 酵母 中 诱 导 表 达 成 功 ， 有 助 于 抗 () 分 子 疫 苗 的 研 究 。关 键 词 严 重 急 性 呼 吸 综 合 征 () 病 毒 核 衣 壳 蛋 白 )E-
3、?,;?AO EI39314FG7/5/: *256F78 *+,#-. H56 7/80138 :4 3L*9366 7/ 6511I594FB136 1393N76753 5/8 :I3/ *097M738O 2%&,3/& EI3 67Q3K87931:74/ 5/8 G563 F5:1I7/J 4M :I3 7/639:38 M95JF3/: H393 7/ 5114985/13 H7:I 409 3L*31:5:74/K HI71I H56 83:39F7/38 GB :I3936:971:74/ 5/8 63R03/17/J 4/ 9314FG7/5/: *256F78 *+,#-
4、. 5/8 60JJ36:7N3 4M 5/ 7/:3J97:B /0123415*678 J3/3O EI33L*936674/ *94801: 4M :I3 J3/3 H56 5*94L7F5:3 CD 5M:39 G37/J *097M738 5/8 783/:7M738 GB *94:37/ 3231:94*I493676O($+&】3N393 510:3 936*795:49B 6B/894F3 () N7906 .0123415*678 *94:37/ )E-?A 中 的 克 隆() 病 毒 株 序 号 为 Z!%， 由 香 港 中 文 大 学 提供 。 根 据 () 病 毒 核
5、衣 壳 蛋 白 的 基 因 序 列 及 碱 基 互补 原 则 ， 利 用 计 算 机 软 件 ?(!双 酶 切 核 衣 壳 蛋 白 基因 和 质 粒 5678#， EP A.B 连 接 酶 （ 1)I+K(） 连 接 ， 转化 ! #$%& T,&， 生 物 素 和 氨 苄 青 霉 素 筛 选 阳 性 克隆 。 限 制 性 内 切 酶 购 自 QU 公 司 ， EP A.B 连 接 酶 ， 1LM聚 合 酶 ， 胶 回 收 和 质 粒 提 取 试 剂 盒 都 购 自 1)I+K( 公司 。,V ! 阳 性 克 隆 的 鉴 定 123 鉴 定 和 酶 切 鉴 定 ： 分 别以 提 取 的 阳 性
6、 克 隆 质 粒 A.B 为 模 板 ， 按 照 前 述 的 反 应体 系 123， 取 产 物 经 ,W琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 在 紫 外 透 射仪 下 观 察 结 果 。对 以 上 所 提 取 的 阳 性 克 隆 质 粒 A.B 进 行Q(IR!、 S(!双 酶 切 消 化 。 反 应 体 系 在 $%O水 浴 $X。 酶 切 产 物 经 ,W的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 观 察 结 果 。 上 述鉴 定 阳 性 的 克 隆 质 粒 送 杭 州 华 大 测 序 鉴 定 。,V $ 核 衣 壳 蛋 白 基 因 在 真 核 细 胞 中 的 诱 导 表 达 应用 8V FV 7(;H2
7、I5EJG(!双 酶 切 消 化 ， $%O水 浴 $ X， 酶 切产 物 经 ,W 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 观 察 ， 结 果 也 按 预 期 将重 组 质 粒 酶 切 成 载 体 和 核 衣 壳 蛋 白 基 因 两 部 分 ， 见图 ,。 再 将 通 过 上 述 鉴 定 的 阳 性 克 隆 质 粒 送 杭 州 华 大测 序 鉴 定 ， 测 序 结 果 证 明 所 插 入 片 段 正 是 核 衣 壳 蛋 白基 因 。!V ! 核 衣 壳 蛋 白 的 表 达 和 免 疫 印 迹 酵 母 菌U.C8F, 中 重 组 质 粒 表 达 产 物 经 纯 化 后 8A891BY7 分析 ， 发
8、现 产 物 相 对 分 子 质 量 在 PN 左 右 ， 见 图 !。 纯化 产 物 转 印 硝 基 纤 维 素 膜 ， 再 与 抗 # _ XG; 抗 体 结 合 ，在 相 对 分 子 质 量 PN 左 右 出 现 反 应 条 带 ， 见 图 $， 证明 重 组 克 隆 正 常 表 达 ， 表 达 产 物 正 是 核 衣 壳 蛋 白 。 讨 论我 们 通 过 随 机 引 物 逆 转 录 获 得 8B3892C 短 片 段A.B， 在 核 衣 壳 蛋 白 基 因 全 长 中 找 到 合 适 的 单 酶 切 位点 .X+!， 在 合 适 位 点 设 置 引 物 ， 使 合 成 的 片 段 .,、
9、注 ： 4 ()*+)c ,4 U.C8F, 对 照 表 达 全 菌 c !4 U.C8F, 对 照 表 达 纯 化 物 c$4 U.C8F,95678# 表 达 全 菌 纯 化 物 c P4 U.C8F,95678# 表 达 全 菌 P Xc N4U.C8F,95678# 表 达 全 菌 X图 # 56789. 表 达 蛋 白 （ 核 衣 壳 蛋 白 ） 电 泳 图实 用 医 学 杂 志 !# 年 第 ! 卷 第 !$ 期!%&! 长 度 在 ( )* 左 右 ， 且 使 相 邻 片 段 部 分 重 叠 ， 共 有一 个 酶 切 位 点 +,!， 以 利 于 酶 切 连 接 成 全 长 片
10、段 。 结果 表 明 核 衣 壳 蛋 白 基 因 全 长 & !#- )*， 蛋 白 的 相 对 分子 质 量 约 为 ./ 左 右 。在 0120 流 行 之 初 ， 刺 突 蛋 白 被 认 为 是 01203456与 宿 主 细 胞 结 合 的 媒 介 分 子 ， 成 为 0120 治 疗 和 疫 苗研 究 的 主 要 方 向7.8。 核 衣 壳 蛋 白 在 病 毒 的 研 究 中 同 样具 有 很 重 要 的 地 位 。 核 衣 壳 蛋 白 处 于 病 毒 颗 粒 的 核 心部 分 ， 以 和 21 结 合 的 形 式 存 在 ， 病 毒 21 在 细 胞 质中 复 制 完 成 以 后
11、和 核 衣 壳 蛋 白 结 合 ， 结 合 产 物 在 被 膜蛋 白 （ 9:;, *=5?,） 识 别 并 被 包 装 到 病 毒 颗粒 中 。 这 个 过 程 中 存 在 两 个 识 别 过 程 ， 一 个 是 蛋 白并 不 会 和 任 意 大 小 的 病 毒 21 结 合 ， 而 只 会 和 完 整 的病 毒 21 结 合7/8。 核 衣 壳 蛋 白 还 能 在 0120 病 毒 敏 感细 胞 系 6,=5 A# 细 胞 中 激 活 B3C， 进 一 步 研 究 表 明0120 冠 状 病 毒 蛋 白 在 病 毒 致 病 过 程 中 起 着 重 要 作用7#8。因 此 对 核 衣 壳 蛋
12、 白 基 因 的 克 隆 表 达 并 制 备 抗 核衣 壳 蛋 白 的 抗 体 以 及 相 关 的 研 究 ， 也 同 样 成 为 0120治 疗 和 疫 苗 研 究 的 主 要 方 向7% 8。 D2EDFG 等7/ 8用0120 病 人 恢 复 期 血 清 检 测 0120 病 人 咽 漱 液 培 养 上清 ， 发 现 大 部 是 核 衣 壳 蛋 白 。 由 于 灭 活 疫 苗 免 疫 原 性不 强 ， 在 实 际 应 用 中 存 在 一 些 限 制 ， 而 研 制 抗 0120的 分 子 疫 苗 是 一 个 新 的 可 能 的 解 决 途 径 。 H1I 等7. 8通 过 利 用 刺 突
13、 蛋 白 基 因 的 J1 疫 苗 ， 在 刺 激 小 鼠 体内 免 疫 系 统 后 ， 产 生 特 异 性 细 胞 免 疫 和 体 液 免 疫 K中和 性 抗 体 L， 并 且 使 实 验 动 物 能 抵 抗 病 毒 的 攻 击 ， 说明 该 J1 疫 苗 在 小 鼠 体 内 可 产 生 抗 病 毒 作 用 。 酵 母菌 是 真 核 细 胞 ， 具 有 翻 译 后 加 工 的 特 性 ， 同 01203456的 宿 主 细 胞 相 类 似 ， 能 更 好 地 表 达 核 衣 壳 蛋 白 ， 避 免在 大 肠 杆 菌 中 生 成 包 涵 体 。 核 衣 壳 蛋 白 在 酵 母 细 胞中 能 正
14、 常 折 叠 ， 更 好 地 保 留 它 的 生 物 学 活 性 。 我 们 在真 核 细 胞 酵 母 菌 中 成 功 表 达 和 纯 化 核 衣 壳 蛋 白 ， 为进 一 步 研 究 核 衣 壳 蛋 白 和 病 毒 的 组 装 打 下 基 础 ， 为下 一 步 研 制 抗 0120 病 毒 分 子 疫 苗 打 下 了 坚 实 的 基础 。! 参 考 文 献2EM1 N 1O ECA20MA P 0O PE2EA 0 0O ,? ; 5T ;R5=5;U=V9 ;995R;?,W X?+ 9,U,=, ;RV?,=, 9*=;?5=Y 9YW=5:, 7Z8 Q0R,R,O !$， $K/#!
15、.L： &$-. &$-QP1221 P 1O ZEA0 0 ZO 10MA 4 2O ,? ;5:, 9,V,R, 5T?+, 01203;995R;?,W R5=5;U=V9 7Z8 Q 0R,R,O !$， $K/#!.L：&$- &.Q车 小 燕 ， 丘 立 文 ， 潘 玉 先 ， 等 Q 0120 冠 状 病 毒 蛋 白 单 克 隆 抗 体的 快 速 、 高 效 制 备 的 方 法 研 究 7Z8 Q 第 一 军 医 大 学 学 报 ， !$， !$K%L： #. #.!QH1I _ HO DEI NO Fa1I HO ,? ;, WVR,90120 R5=5;U=V9 ,V?=; ;W *=5?,R?U, :V?Y :R, 7Z8Q;?V=,O !.O .!(K#-(!L： /#& /#.QD2EDFG EO G HO 1JEE6 1O ,? ; 5T *=5?,9 T=5: ?+, 0120 U=V9： ; *=,;=Y =,*5=?7Z8Q P5 5T B3c;*;C )Y?+, TV?+ VR 5T ?+, 0120 R5=5;U=V9 7Z8Q 1R?;C5R+: C5*+Y9 0O !/O $%K-L： #% #&!QI1E O M1PG 1O 0EEB 1O ,? ;U=V9 U;RR, :5c,Y9 7Z8 Q ;R,?O !$， $#
