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1、乳制品中抗生素残留现状及其检测方法摘 要：抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质，造成经济损失。本文综述了乳制品中抗生素残留的来源现状和危害，以及各种抗生素残留的检测方法。关键词：乳制品；抗生素残留；检测方法牛乳是营养丰富的天然食品，鲜乳中有上百种化学成分，总乳固体平均质量分数为 13.0%，其中脂肪 4.0%、蛋白质 3.4%、乳糖 4.8%、无机盐 0.8%（其中 Ca0.11%），含有几乎所有的脂溶性和水溶性维生素1。含有几乎人体所需的全部营养素及具有保健功能的生物活性物质。牛乳可 谓是最好的钙源，同时，乳品能提高免疫力、降低胆固醇、防治动脉硬化、心血管系统疾病、抗胃溃疡等。酸
2、乳还有延年益寿、抑制肿瘤生长的作用2。牛初乳中含有 25 种矿物质，Ca、P、Na、Zn、Fe、Mn 等的含量明显高于常乳，蛋白质含量是正常乳的 8 倍，乳糖含量低，富含维生素，同 时含有免疫球蛋白、脯氨酸多肽（PRO）、类胰蛋白酶生 长因子（IGF-1 ）、神经营 养生长因子（NGF）、表皮生长因子（EGF）、乳酸过氧化物、核苷及皮质醇、酶等多种生物活性物质。利用免疫乳生产技术提升初乳中免疫物质含量3，对甲、乙型肝炎，霍乱，流感等传染性疾病， 对脑、心、肺血管内科病，对隐性孢子寄生虫病，对龋齿口腔病和各种炎症感染等等都有非常明显的医疗功能作用4。抗生素残留现状乳制品及乳制品工业发展迅速的同时
3、，畜牧业也发展迅猛，-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大 环内酯类 等抗生素在乳畜饲养业中广泛应用，而抗生素在畜牧业中的广泛应用，不可避免地造成牛奶中残留抗生素。抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质，造成经济损失。我国乳制品中抗生素的残留现状不容乐观，2006年的一份对北京、天津、石家庄 5 个零售点的 77 个牛奶样品进行 -内酰胺酶的残留检测，63.6%的样品检测为阳性。一项对我国几个大城市如西宁、南宁、广州、杭州、泉州、北京等城市乳制品质量的检测调查结果显示，在近八百份乳品采样中，抗生素残留超标居不合格项目第一位。 乳及乳制品中抗生素残留，给消费者健康带来了潜在威胁，因而提高
4、抗生素残留的检测技术显得尤其重要，尽快开发或引进先进的抗生素检测技术以解决我国当前乳和乳制品行业面临的难题已成为当务之急。 抗生素残留的来源及其危害一般认为，对泌乳牛用药不当或不注意安全时间是牛乳中抗生素残留的重要因素，使用抗生素防治动物疫病。对患病奶牛用药不当及不遵守停药期是造成牛奶中抗生素残留的重要因素。尤其是使用乳房灌注法治疗乳腺炎时，易造成牛乳中抗生素残留。随着畜牧业的发展，在牛饲料中添加饲料添加剂已十分广泛，其中含量有一定比例的抗生素，主要作用是预防疾病的发生，这也是牛乳抗生素残留重要原因。此外，在高温季节，一些不法交奶户为防止乳的酸败，往往向牛乳中掺杂各种抗生素，来抑制微生物的生长
5、、繁殖，防止牛奶酸败变质这也是乳中抗生素残留的一个来源。牛奶是老少皆宜的营养品，牛奶中若含有抗生素，对长期饮用者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，对抗生素有过敏体质的人服用残留抗生素的乳后会发生过敏反应。即使是正常饮用者，体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素是奶牛场治疗乳房炎的常规药物，由于长期大量使用，使耐药菌株增加，一些乳房炎病例变得难以用常规方法治愈。这种情况又促使临诊兽医在治疗过程中加大抗生素的用量。此外，牛奶中抗生素残留会影响奶制品品质，如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等，则残留在其中的抗生素会抑制细菌的发酵，使产量和质量降低。抗生素残留检
6、测方法的研究进展目前抗生素残留检测的方法很多，基本上可以分为四大类型：一是经典的微生物检测方法；二是现代仪器分析方法；三是生化免疫分析法；四是专一试剂盒法。1 经典微生物检测法其 测定原理基于抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作检测用，因而与临床应用的要求一致，但其测定时间长且结果误差较大。如 TTC 法、戴 尔沃检测 （Delvotest SP）法 5、BY 法等。1.1 TTC 法 TTC 法是国际上较 早通用的标准测定法，也是我国鲜奶中抗生素残留量检验标准（GB4689.27-94）规定的检测 法。如果牛奶中含有抗生素，则加入菌种（嗜热链球菌）经培育 2.5-3h 后，加入 TTC 指
7、示剂（三苯基四氮唑）不发生还原反应，所以样品呈无色状态；如果牛奶中不含抗生素，则样品呈红色6。 TTC 法检测的各种抗生素灵敏度如下：青霉素为 0.004 单位、链霉素 0.5 单位、庆大霉素 0.4 单位、卡那霉素5 单位。TTC 法主要对于青霉素类和氯霉素药物敏感，但对链霉素不太敏感，对新霉素根本不敏感，并且消毒剂可干扰 TTC 试验。TTC 法检测抗生素残留虽然费用较低，但检测方法消耗时间也相对较长，因此应用受到一定限制7。2 戴尔沃检测（Delvotest SP）法是由荷兰其试剂是由荷兰 DSM 公司生产并由 AOAC 认证。原理是利用微生物嗜热芽胞菌在 64条件下培养 2.53h 后
8、会产酸，酸引起指示剂 BCP(溴甲酚紫)变为黄色；若牛奶样品中不含抗生素，培养后样品呈黄色，如样品中含有抗生素, 嗜热芽胞菌生长受到抑制而无法产酸，指示剂将不变色。可检测到 -内酰胺类抗生素在内的更多抗生素，如磺胺类、四环素类等，其中 对青霉素和磺胺类抗生素特别灵敏8。Delvotest SP 法操作方便，严格 实用，容易判断，结果可靠，费用适中等优点；但也易出现假阳性，此方法适用于农场、企业、实验室及政府监测部门。2.1 BY 法BY 法，也称蓝黄检测法，是一种广 谱的微生物抑制法，能在 较短的时间里检测到乳制品中抗生素的残留，通过颜色的对比判断阳性、阴性和可疑样品。 BLinage 等通过
9、这种方法对 -内酰胺类、大环内酯类、四环素类等 25 种抗生素进行了检测，其残留的检测限与欧盟规定的检测限很接近9。此方法耗时短，操从简单，检测抗生素种类较多，但误差较大，容易误检。 3 现代仪器分析方法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或理化特性，借助现代仪器对抗生素残留进行精确分析的一种方法。如色谱法、荧光法、毛细管电泳、色 谱质谱联用技术等。 色谱法有气相色谱（GS）、高效液相色 谱 （HPLC）法、反相高效液相色谱法等。检测的过程运用了色谱理论，通过高灵敏度的检测器，分离速度快、效率高和操作自动化。一般要经过样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤，能 检测抗生素的具体
10、含量。蔡颖用反相 HPLC 法测定乳制品中土霉素、四 环素和金霉素残留量。检测限为：土霉素为 15.0g/kg、四环素为 20.0g/kg、金霉素为 18.0g/kg10。Jian Wang 等运用超高效液相色 谱和飞行 质谱联用(UPLC/Q-Tof MS)和 LC/MS/MS 测定牛奶中大环内酯类抗生素的残留量，其检测限为：红霉素 40ug/kg，泰乐菌素 50ug/kg，替米考星 50ug/kg，能满足各国对这六种 -内酰胺类抗生素的最低检出要求。3.1 高效液相色谱法高效液相色谱是目前广泛应用的一种理化检测方法，它引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测器，实
11、现了分离速度快、效率高和操作自动化。高效液相色谱法测定牛奶中的药物残留都要经历样品处理（包括样品的提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等步骤）、残留药物的分离和残留药物的检测。样品的提取一般使用水和酸化有机溶剂，两者可以同时达到脱蛋白和萃取残留的目的。加拿大 HAL 使用钨酸钠、硫酸和水从组织中提取青霉素并脱掉蛋白质。这种方法对牛奶中的青霉素效果非常好。样品经提取后要进行蛋白质沉淀。脱蛋白的常用有机溶剂有甲醇、乙腈和 2-丙醇；无机酸有硫酸和钨酸钠，酸化乙腈（Ph4.0 4.4），以及超滤法等。Bioson 等通过 把青霉素萃取入水相中，在硫酸和 钨酸钠的存在下，已能减少几种非极性化合物的污
12、染，得到比较干净的水提取液。为了从生物体液和动物组织中提取青霉素残留，Barker 等提出了基体固相分散技术（MSPD），即把样品基体与固相填料（如 C18 填料）混合搅拌均匀，然后把搅拌均匀的物质填充到层析柱中，用适当的溶剂淋洗上层分析物。通常，得到的水提取液或有机提取液中，目标分析物浓度都有很低，还含有许多共萃物，如果这些物质在最终的溶液中存在，不仅会损害色谱仪器，也会增加检测的噪音，无法测定痕量浓度的目标分析物。为了降低背景化合物的干扰，通常需要对目标分析物进行净化与浓缩。常用的净化和浓缩方法有离子交换（IE）、固相萃取（ SPE）和免疫亲合色谱法（IAC）。Moats 等在分析青霉素残
13、留 时,首次尝试验把自动在线痕量富集的方法用于样品净化。这种半自动化技术使用馏分收集器收集色谱淋洗液中预先确定的馏分。把收集到的馏分浓缩后，再进行液相色谱测定。此法已用于测定牛奶中的羟氨苄青霉素，邻氯青霉素和苯氧甲基青霉素、氨苄青霉素和羟氨苄青霉素。残留组分的分离方式包括正相、反相和离子交换等几种分离手段。近几年来大都有改用反相色谱法，最常用的分析柱填料为 ODS-C18。反相 HPLC 具有高效、短时，并在含水系统中完成分析等特点。某些含有立体异构体的药物，如氨苄青霉素、苯氧乙基青霉素以及羧苄青霉素等，也可用离子对反相（RP ）HPLC 来改善其分离效果。但对强极性的青霉素类药物，如头孢三嗪
14、，分离效果不甚理想。在流动相中加入离子对试剂，以改善其分离的选择性。青霉素药物被分离后，最常用的检测方式为浓度型的紫外检测器和荧光检测器。彭莉等11报道了用高效液相色谱法（HPLC）检测牛奶中氯霉素的残留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中残留的氯霉素，用正烷-氯 仿（1+1， V/V）溶解残渣，以乙腈-0.005mol/L 磷酸氢二铵（18+82，V/V）作为流动相，用高效液相色谱仪紫外 检测器在 278nm 检测。平均加收率 94.8%，变异系数12.0%。样品前处理简单、回收率高、实用性强、检疫灵敏度高、重现性好、 检测数据准确可靠，可作为牛奶中氯霉素残留检测的确证方法。仪器分析方法分离速度快、效
15、率高和自动化程度高，能检测抗生素的具体含量，敏感性较高，结果准确，但待检样品需经一系列的预处理，繁琐费时， 还必须有相应的价格昂贵的仪器设备。一般在大型实验室使用，适合于精确测定。3.2 生化免疫法目前应用的生化免疫分析技术，是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。其基本原理是抗原抗体的竞争性结合。可分为酶联免疫测定法（ELISA）、荧光免疫 测定法(FIA)、免疫分析技术与常规理化分析技术联用的方法等。酶联免疫吸附测定(ELISA) ：以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。因为结合了免疫反应和酶催化反应，所以是一
16、种特异而又敏感的技术。YONG JIN 运用酶联免疫法(ELISA)对庆大霉素的检测限度为 0.5 ng/mL。Bucknal 等运用免疫检测法测 定了在牛奶中几种喹诺酮药物的残留量。酶联免疫法测定，其敏感性和特异性好，检测的灵敏度以普遍使用的 - 内酰胺类计：青霉素为 5ppb，阿莫西林为 10ppb，氨苄西林为 10ppb，头孢西林为 8ppb12。其检测结果快速准确，9分钟内即可检测出牛奶中 -内酰胺类、四环素类、磺胺类等抗生素的残留含量，可监控牧场用药的情况。荧光免疫测定(FIA) 法原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4- 甲基 伞形酮， 检测产物发出的荧光，荧光强度与抗原抗体复合物(Mb)浓度呈正比，可在 8min 内得出结果。 结果以 Mb 每小时释放的速率表示 (Mb)表示。Huth 已经用荧光免疫法测定了牛奶中的 6种 -内酰胺类抗生素，得到它们的
