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1、分子生物学研究：核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。1953 年，Watson 和 Crick 提出脱氧核糖核苷酸的双螺旋膜型。染色体包括：DNA 和蛋白质两大部分。基因组：由生物体内所有的染色体组成的。真核细胞染色体的组成包括：蛋白质：组蛋白（染色体结构蛋白，组成核小体） 、非组蛋白（RNA 聚合酶、肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白） ，真核生物基因组 DNA，染色质和核小体。DNA 包装步骤：（核小体，螺线管，超螺线管，染色体）1)核小体的形成是染色体中 DNA 压缩的第一阶段。核小体的组成：组蛋白+200bp DNA。 核小体组蛋白：H 2A、H
2、2B、H 3、H 4 各两分子生成的八聚体，并伴有 H1 在核小体在外边，直径 10nm。2)将 200bp 的 DNA 分子（2nm）缠绕在核小体外，从 68nm 压缩到 10nm 中，压缩率 1/73)六个核小体形成一个螺线管，压缩率 1/6，直径 30nm4)螺线管形成超螺线管，压缩率 1/40，直径 4000nm5)超螺线管形成染色单体，压缩率 1/5DNA 的结构：（1）DNA 的一级结构：四种核苷酸的连接排列顺序。（2）DNA 的二级结构：两条多核苷酸链反相平行盘绕所成的双螺旋结构。（3）DNA 的高级结构：多数为双链 DNA，少数为单链；形成超螺旋，构成质粒分类：右手螺旋（A-D
3、NA 构象、B-DNA 构象） 、左手螺旋（Z-DNA 构象）B-DNA 构象特点：1）A-T 丰富的 DNA 片段常呈 B-DNA 构型；2）脱氧核苷酸在外侧，碱基在内侧；3）链间形成的有螺旋状凹槽构成：大沟、小沟（沟用来接收 Pr 的结合） ；4)相邻碱基对平面间距 0.34nm，结构重复周期 3.4nm，双螺旋直径 2.0nm；5)磷酸二脂键链接核苷酸；6)脱氧核糖环平面基本与纵轴大致平行A-DNA 构象：DNA 模板链与转录所得 RNA 链间形成的双链，双链 RNA 之间形成的构象也是 A-DNA 构象.Z-DNA 构象特点：1）12 个碱基一圈，比 A 构型紧；2）只有一个螺旋沟，难
4、于蛋白质结合；3）重复的结构式二核苷酸；4）碱基不再中央，外圈的碱基难被化学物质结合识别意义：用于调控基因转录，Z 构型变为 B 构型，可以使得近端区域活化转录；使得远端基因转录停止。DNA 的复制：(1)步骤：1) 解链： DNA 链改变构象，从复制叉开始解链，此为 DNA 复制的起点2)拓扑：防止超螺旋3)单链结合蛋白（SSB）结合单链 DNA：4)引物结合：RNA 引物提供 3-OH 末端5) DNA 聚合酶：去掉结合蛋白，切除 RNA 引物6)滑动夹：推动 DNA 聚合酶前进7 )DNA 连接(2)原料：1) 拓扑异构酶； 2)解旋酶；3)单链结合蛋白（SSB） ；4)引物合成酶；5
5、)DNA 聚合酶 3（复制链） ；、6) DNA 聚合酶 1（切引物） ；7) 连接酶；8) dNTP；9 )RNA 引物（含 3-OH 末端）DNA 半保留复制：每个子代分子的一条链来自亲代 DNA，另一条链来自新和成的。DNA 半不连续复制：DNA 复制时，双链解开，SSB 和 DNA 聚合酶 3 共同作用合成前导链随复制叉前进（5端3 端） ；另一条后随链的复制由 RNA 引物开始一个片段一个片段的复制（5端3端） ，形成众多冈崎片段，之后切除引物，用 DNA 连接酶连接断开的单链。DNA 修复：（分类，定义，AP 位点）（1）错配修复：保存母链，修正子链。识别新合成链中的错配并校正 D
6、NA 子链。（2）切除修复：1）碱基切除修复：切除 AP 位点( 存在于 DNA 链上的去嘌呤或去嘧啶位点)两端的磷酸二酯键，换上相应的核苷酸。2）核苷酸切除修复：切除无法形成氢键的核苷酸。DNA 的转座：或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。转座子：又称易位子，存在于染色体 DNA 上的可自主复制和移位的基本单位。分类：插入序列（IS） 、复合型转座子玉米中的控制因子：Ac-Ds 系统（激活- 解离系统）：Ac 能够自主转座，形成不稳定基因突变，使 Ds因子活化、转座。Ds 属于非自主因子，解离因子，当 Ac 存在时导致附近结构基因失活和表达水平的变化。转座作用的机制：转座可被分为
7、复制型和非复制型两类。基因表达：转录（拷贝出一条与 DNA 链序列完全相同的 RNA 单链的过程，是基因表达的核心步骤）和翻译（以新生的 mRNA 为模板，把核苷酸三联遗传密码翻译成氨基酸、合成多肽的过程，是基因表达的最终目的） 。DPPH 依赖于 RNA 聚合酶基因转录：(1)启动子：基因转录起始所必需的一段 DNA 序列，确保转录精确起始，是基因表达调控的上游顺式作用元件之一。是指确保转录精确而有效地起始的 DNA 序列。(2)转录单元：是一段从启动子开始至终止子结束 DNA 序列，RNA 聚合酶从转录起点开始沿模板前进，直到终止子为止，转录出一条 RNA 连。(3)增强子，或强化子：一种
8、能强化转录起始的序列。(4)原核生物包括：-10 区与-35 区，其最佳距离大约是 16-19bp。真核生物 mRNA 特点：(1)mRNA 的 5端存在“帽子”结构（甲基化鸟嘌呤） ；(2) 绝大多数真核生物mRNA 具有多聚 A 尾巴(1)“帽子”结构作用：1 有助于翻译的开始：与核糖体小亚基相结合； 2 保护 mRNA 不被降解，半衰期长；3 成熟产物运输过程中的必需物质；4 促进转录(2)多聚腺苷酸尾巴作用：1 穿过核膜所必须的部分；2 提高 mRNA 的稳定性；3 与翻译有关原核生物转录终止的类型：不依赖于 因子的终止和依赖于 因子的终止类型RNA 的编辑：是某些 RNA，特别是一种
9、 mRNA 前体的加工方式，如插入、删除、取代一些核苷酸残基，导致 DNA 所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的 mRNA 序列发生了不同于模板 DNA 的变化。核酶：一类具有催化功能的 RNA 分子，通过催化 RNA 链中磷酸二酯键的断裂，特异性剪切底物 RNA 分子，从而断裂基因的表达。其根据不同的核酸具有的催化功能分为：剪切型核酶、剪接型核酶。遗传密码的性质：（1）密码的连续性；（2）密码的简并性（一个氨基酸有多个密码子） ；（3）密码的通用性与特殊性；（4）密码子和反密码子相互作用tRNA 的 L 形状的三级结构（1）tRNA 的种类： 1）起始 tRNA：原核生物起始 tRNA 携
10、带甲酰甲硫氨酸（fMet） ，真核生物起始tRNA 携带甲硫氨酸（Met） ；2）同工 tRNA；3）校正 tRNA无义突变：蛋白质合成提前终止（合成 UAG、UGA、UAA） ，合成无功能的多肽。错义突变：结构基因中某个核苷酸变化，使得一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。（2）氨酰-tRNA 合成酶：是一类催化氨基酸与 tRNA 结合的特异性酶。AA-tRNA 合成酶既要识别tRNA，又要能识别氨基酸它对两者都具有高度的专一性。蛋白质的生物合成包括：1、氨基酸活化 2、肽链的起始 3、伸长、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。在真核生物中，起始氨基酸是甲硫氨酸，在原核生物中，起始氨基酸是甲
11、酰基氨基酸。生物翻译：（1）原核生物翻译的起始：1）30SrRNA 和 50SrRNA 相分离2）30S 小亚基先与 mRNA 模板 相结合（需要识别 SD 序列）3）30S 小亚基再与 fMet-tRNAMet（甲酰甲硫氨酸-氨酰 tRNA）结合4）30S 小亚基与 50S 大亚基结合(2)真核生物翻译的起始：1）40SrRNA 与 60SrRNA 相分离2）40S 小亚基首先与 fMet-tRNAMet 结合3）40S 小亚基 mRNA 模板相结合（无需识别 SD 序列）4）40S 小亚基与 60 S 大亚基结合成 80SmRNAMet-tRNAMet 起始复合物(3)原核与真核的不同：1
12、)真核核糖体较大 ;2)有较多的起始因子参与;3)mRNA 具有 m7GppNp 帽子结构;4)Met-tRNAMet 不甲酰化;5)mRNA 分子参与形成起始复合物蛋白质前体的加工：1、N 端 fMet 或 Met 的切除；2、二硫键的形成； 3、特定氨基酸的修饰；4、切除新生肽链中的非功能片段。蛋白质转运分类：1、翻译-转运同步机制运输：信号链； 2、翻译后运转机制运输：传导链重组 DNA 技术：按照人的意愿，在体外对 DNA 进行重组，通过导入细胞的分子，并能大量扩增和繁殖。限制性内切核酸酶：是一类能够识别 DNA 分子中的某种特定核苷酸的序列，并由此切割 DNA 双链结构的核酸内切酶。
13、基因工程技术路线：（1）获得目的基因和载体。（2）切割、连接新的重组 DNA 分子。（3）重组 DNA 分子导入受体细胞，并在细胞中复制遗传。（4）对转化子筛选和鉴定。（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。核酸凝胶：琼脂糖凝胶电泳和聚丙乙酰胺凝胶电泳。染色：适量溴乙锭（EB） 。细菌转化：（1）概念：一种细菌菌株由于捕获来自供体菌株的 DNA 而导致性状发生可遗传性改变的过程。（2）感受态细胞：易于接受外源 DNA 的细胞。（3）转化的方法：电击法、CaCl2 法（4）CaCl 2 法是制备大肠杆菌 感受态（或许 DNA 能力增强的状态）最常用的化
14、学方法。聚合酶链式反应技术（PCR） ：定义：聚合酶链反应技术，是一种体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的技术。原理：PCR 技术实际上是 DNA 体外合成放大反应。其基本原理是根据细胞分裂中 DNA 的半保留复制机理。PCR 由变性- 退火-延伸三个基本反应步骤构成。模板 DNA 的变性模板 DNA 与引物的退火(复性) 引物的延伸 循环 4原料：模板 DNA、PCR 引物、dNTP、Mg2+ （保真） 、DNA 聚合酶方法： 1）高温变性（解链）：94，5S；2）低温退火（引物与模板 DNA 结合）：50；3）适温延续（DNA 合成）：72。实时定量 PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异
15、性的探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。（1）染料：SYBR Green I，激发波长 520nm，只能与 DNA 双链结合，并且只有在与 DNA 结合时才能被激发出荧光。缺点：只能识别 DNA 双链而不能区分不同的 DNA 双链分子。TapMan 探针（一端是短波长的荧光基因，一段目的 DNA 特异的碱基序列、另一端是长波长荧光基因。两荧光基因俱在时，荧光猝灭；而当短波长的荧光基因单独存在时，在激发光下产生绿色荧光）（2）Ct 值：产物荧光强度首次超过设定阈值，PCR 反应所需的循环数。基因组 DNA 文库：把
16、某种生物的基因组全部 DNA 序列切成适当大小，分别与运载体组合，导入微生物细胞，形成克隆，而克隆片段的总汇成为基因组 DNA 文库。RNA 基本操作技术：（1）总 RNA 的提取：首先，裂解破碎细胞，离心除去细胞核（除去绝大部分 DNA） ，用有机溶剂使蛋白质沉淀变性，同时抽提 RNA（在水相） ，在抽提液中加入酚：氯仿：异物醇（25：24：1） ，离心后上层为水相，含有 RNA，下层为有机相，变性的蛋白质和 DNA 位于两相界面间。吸出上层水相，在高浓度的乙醇或异丙醇作用下，离心得到 RNA 沉淀，即细胞总 RNA。（2）mRNA 的纯化： 首先要从细胞中分离出总 RNA，然后再从中提取 mRNA。个哺乳动物细胞约含10-5ug RNA，其中 80 85为 rRNA，约 15为低分子量 RNA (tRNA 及核内小分子 RNA 等) ，仅1 5为 mRNA。虽然 mRNA 的大小不一致( 数百至数千碱基)，核苷酸序列各异，但它们有相同的 3末端多聚腺苷酸尾(Poly A 尾) ，据此可用寡
