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1、二代测序技术比较 Illumina_、454_、ABI_测序仪比较.docIllumina 、454 、ABI 测序仪比较Illumina 测序仪Illumina 公司的新一代测序仪 Genome Analyzer 最早由 Solexa 公司研发，利用其专利核心技术“DNA 簇” 和“ 可逆性末端终结（reversible terminator）”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序。Illumina 公司于 2007 年花费 6 亿美金的巨资收购了 Solexa，就是为了促成 Genome Analyzer 的商品化。Genome Analyzer 作为新一代测序技术平台，
2、具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学 （基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。Genome Analyzer 自上市以来，已经为千人基因组计划立下了赫赫战功。今年早期，荷兰科学家利用它首次绘出女性的基因组图谱。而就在前两周，Nature杂志上一连出现三个人类基因组图谱：炎黄一号-第一个亚洲人图谱；第一个癌症病人图谱；第一个非洲人图谱。它们全是依赖 Genome Analyzer 完成的。哗，一下就来仨！这和第一个人类基因组图谱的 13 年形成了多么鲜明的对照。根据去年底的数据，Genome Analyz
3、er 已售出约 200 台，估计是市场占有率最广的。前不久，华大基因再添置了 12 台，准备放在香港和深圳的实验室，至此华大基因已经有 29 台 Genome Analyzer。而著名的麻省理工学院和哈佛大学 Broad 研究院拥有 47 台 Illumina 测序仪。众多实验室之所以选择 Illumina，看中的无疑是 Genome Analyzer 的高性价比。上个月，Illumina 将 Genome Analyzer II 升级到 Genome Analyzer IIx，距年底实现单次运行获得 95 GB 数据的宏伟目标又近了一步。Genome Analyzer IIx 有两个核心特征
4、：其一是更大的试剂冷却器，支持超过 100 个测序循环，进一步提升了系统的易用性和自动化；其二是全新的流动池支架，让每轮运行所得的高质量数据增加 20%。依靠系统软件和试剂的改进，Genome Analyzer IIx 现在能够支持 100 bp 以上的配对末端读长，并在每次运行中产生超过 20 GB 的高质量数据。Genome Analyzer 技术的基本原理：1. 文库制备将基因组 DNA 打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。2. 产生 DNA 簇利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA 片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固
5、定”在芯片上。另外一端（5 或 3）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，形成“ 桥 (bridge) “。反复 30 轮扩增，每个单分子得到了 1000 倍扩增，成为单克隆DNA 簇。DNA 簇产生之后，扩增子被线性化，测序引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。3. 测序Genome Analyzer 系统应用了边合成边测序（Sequencing By Synthesis）的原理。加入改造过的 DNA 聚合酶和带有 4 种荧光标记的 dNTP。 这些核苷酸是“可逆终止子” ，因为 3羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板
6、序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复 3端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板 DNA 片段的序列。目前的配对末端读长可达到 250 bp，更长的读长也能实现，但错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。4. 数据分析自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析。Genome Analyzer 系统之所以如此畅销，关键在于其技术上的优势。1. 可扩展的超高通量Genome Analyzer 系统目前每次运行后可获得超过 20
7、GB 的高品质过滤数据。这个技术的可扩展性保证了更高的数据密度和输出，能用更少的经费完成更复杂的项目。到今年底，通量还有望上升到 95 GB，相当于人类基因组的 30 倍覆盖度。2. 需要样品量少Genome Analyzer 系统需要的样品量低至 100ng，能应用在很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。这也是很多研究人员所考虑的因素。3. 简单、快速、自动化Genome Analyzer 系统提供了最简单和简洁的工作流程。即使是最小的实验室也能像大型基因组中心一样进行大规模的实验。制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。Cluster Station
8、可以说是 Genome Analyzer 的核心。由独立软件控制的自动生成DNA 簇的过程可以在 5 小时之内（30 分钟手工操作）完成。这个自动化的流程不需要进行Emulsion PCR，减少了手工操作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。快速的实验流程使 Genome Analyzer 的能力增至最大，而自动化步移降低了项目的时间和费用。4. 新颖的测序化学技术Genome Analyzer 通过合成测序来支持大规模并行测序。利用新颖的可逆荧光标记终止子，可以在 DNA 链延伸的过程中检测单个碱基掺入。由于四个可逆终止子 dNTP 在每个测序循环都存在，自然的竞争减少了掺入的误差。
9、5. 单个或配对末端支持Genome Analyzer 系统支持单个片段或配对末端文库。文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间。制备基因组 DNA 的单个片段或配对末端文库需要 6 个小时，只有 3 个小时需要手工操作。250 个碱基或更长的读长增加了比对基因组的能力，并拓展了在其他方面的应用。然而，精明的用户更看重的是性价比，这也是他们选择 Illumina 的重要原因。Illumina 的售价约为 45 万美元，低于 454 GS FLX 的 50 万和 SOLiD 系统的 59 万（以上皆为美国的售价）。此外，运行成本也是一个关键因素。美国凤凰城翻译基因组学研究院（TGen）的主管
10、 David Duggan 曾表示，当年购买新一代测序仪时，每次运行的费用就成为他下决定的主要因素。他最终选择了 Illumina Genome Analyzer，因为每轮的运行费用为 3000-4000 美元（2007 年的数据），较为合理，而其他测序仪可能更高。当然，他也综合考虑了通量、运行时间和样品量。弗吉尼亚联邦大学的高原（音译）博士认为：“Genome Analyzer 的操作费用、易用性和可扩展性让我实现了大规模基因组实验。现在，我的小型实验室正在进行过去只能在大型基因组中心才能完成的实验。低样品需求、简单的流程、高质量的数据以及应用灵活性让 Illumina Genome Ana
11、lyzer 从其他高通量测序技术中脱颖而出。”ROCH-454 测序仪454 公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005 年底，454 公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统Genome Sequencer 20 System，被Nature 杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454 公司被罗氏诊断公司以 1.55 亿美元收购。一年后，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统 Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。去年 10 月，全新的 GS FLX Titanium
12、系列试剂和软件的补充，让 GS FLX 的通量一下子提高了 5 倍，准确性、读长也进一步提升。想当年，GS 20 的出现，揭开了测序历史上崭新的一页。Jonathan Rothberg 博士就是大规模并行测序的发明者，同时也是 454 的创始人。上世纪 90 年代，很多学者也都想到了大规模并行测序，他们试图将 Sanger 测序移到芯片上，但都以失败告终，因为这项技术没有可扩展性。1999 年， Rothberg 的儿子出世，他放了两个星期的陪产假。小家伙出生后被送入婴儿特护病房，Rothberg 非常担心，甚至想获取儿子的基因组信息。这段担惊受怕的经历给了他灵感，他突然意识到焦磷酸测序（py
13、rosequencing ）不仅简单，而且具有可扩展性。两个星期之后，Rothberg 就开始设计芯片和流动室，让测序在更小的反应室中进行，并同时进行几百万个反应。硬件的设计和制造也只是成功的一半，在样品制备上还有同样漫长的路要走。Rothberg 摒弃了传统的细菌克隆与挑选，将 DNA 打断成随机片段，并寻找一种方法来克隆每个片段。受到其他学者乳液实验的启发，他也想将 DNA 放入油包水的乳液中，这样就省去了反应管。一个好汉三个帮。在 Joel Bader 等人的帮助下，Rothberg 验证了这些想法的可行性，并利用了炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性。就这样，乳液 PCR 终于诞生了
14、。之后，454 生命科学公司用新一代测序仪对 DNA 双螺旋结构的发明者 James Watson 进行了基因组测序。第一份个人基因组图谱的绘制只用了两年时间，花费不到 100 万美元。虽然现在看来这并不算什么，但就当时而言，它相对于人类基因组计划已是质的飞跃。GS FLX 系统的工作流程GS FLX 系统的流程概括起来，就是 “一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长（One fragment = One bead = One read）”。1）样品输入并片段化：GS FLX 系统支持各种不同来源的样品，包括基因组 DNA、PCR 产物、BAC、cDNA 、小分子 RNA 等等。大的样品例如基因
15、组 DNA 或者 BAC 等被打断成 300800 bp 的片段；对于小分子的非编码 RNA 或者 PCR 扩增产物，这一步则不需要。短的 PCR 产物则可以直接跳到步骤 3)。2）文库制备：借助一系列标准的分子生物学技术，将 A 和 B 接头（3和 5端具有特异性）连接到 DNA 片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。具有 A、B 接头的单链 DNA片段组成了样品文库。3）一个 DNA 片段一个磁珠：单链 DNA 文库被固定在特别设计的 DNA 捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链 DNA 片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一
16、个独特片段的微反应器。4）乳液 PCR 扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。5）一个磁珠一条读长：携带 DNA 的捕获磁珠随后放入 PTP 板中进行后继的测序。PTP 孔的直径（29um）只能容纳一个磁珠（20um）。然后将 PTP 板放置在 GS FLX 中，测序开始。放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照 T、A、C、G 的顺序依次循环进入 PTP 板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在 ATP 硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度 CCD 捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基
