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1、1重组人肝刺激物在原核细胞中的表达与纯化 摘要：利用基因重组技术, 构建成人肝刺激因子(hHSS)和谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达载体, 转化大肠杆菌 BL-21 (DE3), 以HisTag 亲和层析纯化表达产物, factor Xa 切割分离 hHSS 单体, 并检测其生物学活性。 结果显示, 在 pET-42a 表达体系中 hHSS 以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在, gST-hHSS 表达量占菌体可溶性蛋白的 30%; Factor Xa 切割 GST 与 hHSS 之间肽腱, 得到 33 和15 kD 两条蛋白带,经 Western 杂交证实 33 kD 条带为 GST, 而 15
2、 kD 条带的分子量与 hHSS 基因序列推测蛋白结果相符。经 HisTag再次纯化可获得 hHSS 单体,初步证实重组 hHSS 具有促进肝癌细胞增殖活性。肝刺激因子(hepatic stimulator substance, HSS)是广泛存在于初断乳动物肝脏或再生肝脏中的一种促肝细胞增殖因子12。有关 HSS 的研究虽取得了一定进展37,但由于它在肝细胞中含量极低, 提取和纯化十分困难, 至今仍未获纯品, 故迄今许多实验仍采用部分纯化的 HSS。这不仅严重制约了 HSS 作用机制的深入研究,也影响了其在临床的实际应用。鉴此, 本实验构建了 hHSS原核表达载体, 体外表达重组 hHSS,
3、 为深入研究 HSS 的调控机制和临床应用提供了物质基础。 1 材料和方法 21.1 质粒的转化与筛选分别以 Sal/EcoR消化表达载体pET-42a(+)(Novagen)和含 hHSS 基因的 pUC18-hHSS (本室构建)。通过 Glassmilk(Bio 101)回收相应片段, 构建 pET-42a-hHSS 表达质粒, 转化 BL-21 感受态细菌。以 Kanamycin 筛选阳性细菌克隆, 再以 PCR 方法鉴定转化细菌是否含有 hHSS 基因,条件为: 94 变性 5 min 后, 94, 50 s; 65, 40 s; 72, 1 min 40 s; 反应 30 次循环;
4、 最后 72 延长 8 min。扩增产物经琼脂糖电泳确证含有hHSS 重组基因的阳性克隆。 1.2 GST-hHSS 融合蛋白的诱导与表达分别取 5 个含 pET-42a-hHSS 转化克隆菌, 接种 LB 培养液, 以 IPTG (1 mmol/L)诱导hHSS 基因表达。4 h 后,以 10000 g 4离心 3 min 收取细菌。加入变性液5mmol/L imidazole, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L tris-HCl (pH 7.9), 6 mol/L Urea悬浮沉淀, 以超声细胞破碎仪裂解细菌。10000g 4离心 3 min, 取上清, 以 BCA(bi
5、cinchoninic acid)方法测定蛋白浓度。通过 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, pAGE)观察不同克隆菌株中 GST-hHSS 表达。 31.3 GST-hHSS 存在部位及表达形式的确定取高表达克隆菌株, 按方法 1.2 中步骤诱导 GST-hHSS 融合蛋白的表达, 离心制备细菌沉淀,提取可溶性蛋白和包涵体蛋白。取诱导前细菌总蛋白、诱导后培养液上清、 诱导后可溶性蛋白和包涵体蛋白各 50 g, 经 12%SDS-PAGE 分离,用考马斯亮蓝(R-250)染色, 观察融合蛋白表达部位与形式。另取上述平行样品
6、蛋白各 5 g ,按照狭缝杂交法将蛋白印渍于尼龙膜。该膜经 5%脱脂奶粉过夜封闭 (4), 次日与抗多聚组氨酸(HisTag)抗体(Novagen) 杂交 1 h,继而再与辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG(Sigma)孵育 1 h。之后, 将膜充分漂洗, 迅速加入发光试剂(Santa Cruz) 进行化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL), 检测杂交信号强度。 1.4 GST-hHSS 融合蛋白的纯化与含量的测定 将方法 1.3 中提取的可溶性蛋白和包涵体蛋白, 以 0.45 m 滤膜过滤, 按 HisTag亲合层析方法分离融合蛋白。融合蛋白的 HisTag
7、 与亲合层吸柱中Ni2+发生耦联而被吸附,先以低浓度咪唑液 (60 mmol/L)洗脱去除杂蛋白, 再以高浓度咪唑(1 mol/L)洗脱亲合的目的蛋白 , 即可获得纯化的 GST-hHSS 融合蛋白。取诱导前细菌总蛋白(30g)、 未纯化的细菌可溶性蛋白及包涵体蛋白(各 30 g)、 纯化的可溶性融合蛋白及包涵体融合蛋白(各 3 g), 经 12% SDS-PAGE 电泳分离,用考4马斯亮蓝(R-250)染色。以 GS-700 密度扫描蛋白条带密度 , 计算GST-hHSS 融合蛋白占 BL-21 菌体蛋白的百分含量。 1.5 GST-hHSS 融合蛋白酶切取纯化 GST-hHSS 可溶性蛋白
8、, 以 Factor Xa 酶切缓冲液 4过夜透析。次日, 取透析后纯化的可溶性 GST-hHSS 融合蛋白 60g, 分成 6 管, 其中 1 管为阳性对照, 不加酶处理, 其余 5 管依次加入 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1 U 的Factor Xa; 21酶切 24 h, 取 3 g 酶切融合蛋白, 以 12% SDS-PAGE 凝胶电泳, 比较不同浓度 Factor Xa 酶切效果。酶切后的GST-hHSS 以上述方法再次纯化,进行电泳分离。 1.6 重组 hHSS 生物活性的研究采用 MTT 法8 观察重组hHSS 促细胞增殖状况。人肝癌细胞系 BEL-7402 以含 1
9、0%胎牛血清(HyClone)的 DMEM(GIBCO/BRL)培养基培养,按 1104/ml 细胞密度接种于 96 孔培养板, 于 37、 5%CO2 培养箱中培养。待细胞完全贴壁后, 换用无血清 DMEM 培养基(内含 10g/ml 胰岛素)培养 12 h。将终浓度为 0、 160、 240、 320、 400ng/ml 的重组 hHSS 加入培养基, 孵育 24 h 后用六孔重复测定其促细胞增殖活性。另设空白对照,只加等体积培养基, 但不含重组hHSS。每孔加入 20 lMTT 溶液(5mg/ml, 北京华美生物工程5公司)继续孵育 4 h。以酶标仪 (Microplate reader
10、 550, Bio-Rad)测定 490 nm 波长处各孔的吸光值。 2 结果 2.1 含 hHSS 基因转化细胞的筛选 从 pUC18-hHSS 酶切得到 hHSS cDNA, 应用 Glassmilk 回收纯化后, 正向插入 pET-42a 的 EcoR和 Sal 位点。通过卡那霉素筛选, pCR 扩增确证 hHSS 基因正确连接于 pET-42a , 并成功转化到 BL-21 细菌中。 2.2 GST-hHSS 融合蛋白表达形式及含量的测定 不同克隆菌株以 IPTG 诱导 GST-hHSS 融合蛋白的表达。诱导后融合蛋白表达量明显高于诱导前水平, 不同克隆间融合蛋白的表达量也不尽一致,说
11、明相同 条件下各转化细菌间融合蛋白的表达6效率差异较大。 挑选 hHSS 高表达克隆菌的诱导前细菌总蛋白、诱导后培养液上清、诱导后细菌胞浆可溶性蛋白和包涵体蛋白进行SDS-PAGE。 2.3 GST-hHSS 融合蛋白的酶切纯化及活性分析 用 Factor Xa 缓冲液过夜透析融合蛋白后以不同浓度酶切分析, 结果如图 3 所示。在 33 和 15 kD 处有两条明显的染色条带, 分别与 GST 蛋白和 hHSS 蛋白的分子量一致。如未经透析处理,则Factor Xa 的切割效率显著降低。为进一步验证 GST-hHSS 融合蛋白, 以 Western 杂交方法对其进行分析。酶切前的 GST-hH
12、SS 融合蛋白及酶切后 GST 片段均与抗 HisTag 抗体杂交,说明融合蛋白GST-hHSS 和 GST 片段中含多聚组氨酸, 这与 pET42-a 载体中GST 分子量一致。Factor Xa 酶切处理融合蛋白 , 经 HisTag 再次层析分离,可获得纯化的 hHSS 单体分子), 其分子量约为 15 kD, 与HSS 基因序列推测的蛋白分子量相符, 进一步确证 GST-hHSS 融合蛋白表达、纯化及酶切分析策略准确无误。 2.4 重组 hHSS 促细胞增殖的活性 7我们曾报道, 生化提取的 HSS 可刺激体外培养的肝细胞增殖9。本实验将重组 hHSS 加入 BEL-7402 肝癌细胞
13、系, 观察其作用效果, 以此作为鉴定重组 hHSS 生物活性的指标之一。如图 5 所示,在 160400ng/ml 的刺激下, BEL-7402 细胞的增殖加快, 并呈现出剂量-效应反应。在 400ng/ml 作用 24 h 后, hHSS 刺激组细胞 OD490 值较对照组升高 34%,统计学分析表明两组数值具有显著性差异(P0.01), 提示重组 HSS 表现出明显促细胞增殖活性。 3 讨论 利用 DNA 重组技术生产用传统方法难以获得的生物活性分子, 是近年分子医学和医药工程的热点研究课题。我们曾进行 hHSS基因原核表达的研究, 并获得 rhHSS,但多以不溶性包涵体形式存在。从包涵体
14、中进行蛋白复性, 只有少部分蛋白得以复性, 具有活性功能。复性过程是否会影响 rhHSS 的构象还无法确定。以融合蛋白的形式表达目的蛋白,可增加外源蛋白可溶性和稳定性。通过 HisTag 亲和层析方法纯化目的蛋白, 有利于提高重组蛋白的产量和纯度。以GST 融合蛋白技术表达外源基因已有研究1013,但有关 GST-8hHSS 表达、 纯化及酶切分离方面尚未见报道。本研究发现 , 人肝刺激因子不仅以包涵体形式, 还以可溶性蛋白形式存在于细菌中。实验表明, gST-hHSS 占可溶性蛋白含量的 30%, 纯化后 GST-hHSS 的浓度可达 2.6mg/ml 。提取和纯化可溶性 GST-hHSS
15、融合蛋白,避免了变性 -复性等复杂步骤, 减少了对蛋白构象的影响, 增加了蛋白的稳定性14。 Factor Xa 切割 GST-hHSS 融合蛋白可获得 hHSS 单体。Factor xa 活性受离子浓度、 pH 值、 温度、 时间、 变性剂、 酶用量及蛋白质本身属性等多种因素影响。本实验证实, 经过酶切缓冲液透析这一简单步骤处理,可明显提高 Factor Xa 切割 GST-hHSS 的效果 , 对这一改进还未见到有关报道。 本实验首次报道重组 hHSS 融合蛋白的表达和纯化, 并通过对 rhHSS 活性初步检测, 证明重组 hHSS 具有促肝癌细胞 BEL-7402 生长的作用,为进一步研
16、究基因重组 HSS 的功能和作用机制提供了物质基础。 参考文献 1LaBrecque DR, Pesch. Preparation and partial 9;characterization of hepatic regenerative stimulator substance (HSS) from rat liver. J Physiol, 1975,248,273284. Francavilla A, Ove P, Polimeno L, Coetzee M, Makowka L, Rose J, Van Thiel DH, starzl TE. Extraction and partial purification of a hepatic stimulatory substance in rats, mic
