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1、细胞培养基本技术细胞培养的基本概念传代培养细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。一旦进行传代培养，便不再是原代培养，而改称为细胞系。细胞培养 使用单个细胞悬液组织培养 使用组织块（ 薄片（0.2 官培养 使用器官的一部分或整个器官人平滑膜细胞培养24滑膜组织中主要有两种细胞：成纤维细胞样形态呈树枝状贴壁生长；巨噬样平滑膜细胞为单核/巨噬样细胞形态，分裂增殖较慢（箭头处）原代培养的新生大鼠心肌
2、细胞,细胞形态以梭性、多角形为主原代培养细胞的培养周期原代培养期 传代培养期 衰退期初代培养有限细胞系无限细胞系接种培养第一次传代老化死亡转化传代间隔指数细胞数量46810121416180 2 4 6 8 10 12 14 16周指数细胞数量细胞系（：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。 如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（已获无限繁殖能力可以持续生存的细胞系，称为连续细胞系或无限细胞系（。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种
3、还有致瘤性 。细胞株（通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细 胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志物必须在整个培养期间始终存在。由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（克隆（：亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说 ，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。细胞培养方式大致可分为两种：一种是群体培养（，将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，形成均匀的单细胞层；另一种是克隆培养（，将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（。一个
4、细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。培养细胞的特性培养细胞的生长方式：贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。多为各种实体瘤细胞悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。多为各种造血系统肿瘤细胞每代贴附生长细胞的生长过程：游离期；贴壁期；潜伏期；对数生长期；停止期（平台期）形，悬浮生长 形，贴壁生长游离期：细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟5 小时。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。大部分细胞株在 10分钟 5小时内贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这
5、些带正电荷糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再附着在吸附有促贴壁因子的底物上。高级培养瓶多涂有生长基质以帮助细胞贴附。细胞贴壁的基本过程潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性新传代的数增生期 平顶期有限细胞系无限细胞系接种培养细胞数/毫升1060 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13104105天贴附生长细胞的生长过程培养细胞生长的条件细胞的营养需要：特定的培养基和添加剂细胞的生存环
6、境：温度: 37 ； 透压；适宜的湿度 5% 10 H+ 毒害细胞培养所需要的耗材和仪器超净工作台，高压灭菌锅，电热干燥箱，滤器，酸缸学显微镜低温冰箱，液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，移液管，电动移液器，培养皿，冻存管高压灭菌锅：湿热消毒电热干燥箱：干热消毒滤器：过滤除菌，大多数培养用液，包括人工合成培养基、血清、m 滤膜过滤除菌超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。 主要用于操作台、塑料培养皿等表面消毒消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞之间以及细胞和底物的粘连，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超
7、过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无 m 滤膜过滤除菌 。胰蛋白酶液消化时间：细胞种类 不同消化时间也不一样，一般是1血清的培养基可以终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。培养基培养基是维持体外细胞生存和生长的溶液，包括天然培养基和合成培养基。天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好。缺点：来源受限，成分复杂，存在批次的差异，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析，容易发生支原体污染。合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如 成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它
8、一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白和转移蛋白等）； 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等； 各种生长因子； 不明成分 ；一般说来，含5 血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需要10 的血清。对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但血清中的复杂成分至今尚未完全研究清楚。血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长的抑制因
9、子或毒性因子，因此含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年， 20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。向无血清培养基中补充的能促进细胞系生长的添加物都是独特的。适用于某种细胞株
10、的培养基，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。血清质量好坏是细胞培养的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。血清存在明显的批次差异，通常是对各个批次的血清进行试用后再采购效果最佳批次的血清。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。非胎牛血清需要灭活以减少补体和支原体的影响：56，30分钟。一般的血清出厂时都经过严格的检测，不会存在污染。血清在长时间的存放后一般会出现絮状沉淀等不溶物质，不会影响
11、正常的使用，除非经过试用发现存在污染，需要根据污染的种类酌情处理，如果对血清过滤除菌，因为滤膜会过滤掉很多血清的有效成分，所以必须在过滤后提高血清的工作浓度。在培养基配制后，培养基内需要添加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。为了更好的避免抗生素和污染对细胞状态及实验结果的影响，培养基配制后，还需要添加一些氨基酸，包括 必需氨基酸）和丙酮酸钠等，最终使用浓度为每毫升100单位。化学污染是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺激的化学物质。这些污染一般来自于没有洗净的器皿、是革兰氏阴性细菌细胞死亡后解体释放出的疏水
12、性的细胞壁组成物质，对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子，对细胞生长和实验结果产生影响。细菌内毒素是临床上的最主要的热原（即注射到动物体内会导致动物发热），所以通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更是要避免细菌内毒素的污染。生物污染包括细菌、真菌、支原体、病毒和非同种细胞污染，这些污染源能在合适的环境中非常快速的生长。生物污染除病毒和支原体污染外都比较容易观察到，它们往往会使其污染的培养基产生可见的变化，或者通过显微镜可以观察到。由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。但是病毒污染难于发现，因为病毒颗粒特别微小
13、，一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不是致死的，所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细胞的实验结果。细胞培养中的污染1、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养基中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养基变混浊，变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。细胞培养中的污染2、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛
14、霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养基中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养基一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。细胞培养中的污染3、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物， m，约有1%可通过细胞滤器（m ），光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。 多数支原体适合于偏碱条件下生存(，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 支原体污染细胞后，培养基可不发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解。因此
