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1、实验二 电子显微镜的原理及使用,光学显微镜的发明为人类认识微观世界提供了重要的工具。随着科学技术的发展，光学显微镜因其有限的分辨本领而难以满足许多微观分析的需求。上世纪30年代后，电子显微镜的发明将分辨本领提高到纳米量级，同时也将显微镜的功能由单一的形貌观察扩展到集形貌观察、晶体结构、成分分析等于一体。人类认识微观世界的能力从此有了长足的发展。,电镜技术（又称电子显微术）是一门技术性很强的综合性学科。就电镜技术而言，属现代物理学范畴；就组织和细胞的超微结构（含超微病理）而言，属现代分子细胞生物学及形态学范畴。,电子显微镜技术（electron microscopy）是研究细胞亚显微结构的有力手
2、段，因此该技术是细胞生物学的重要研究方法之一。 电子显微镜（electron microscope，EM）是以电子波作为光源，电磁场作透镜，利用电子散射过程产生的信号进行显微成像的大型仪器设备。,电子显微镜的发展史,Max Knoll(1897-1969) Ernst Ruska(1906-1988),电子显微镜的分辨率可以达到纳米级(10-9m)。可用来观察很多在可见光下看不见的物体,例如病毒。Ruska获1986年度的诺贝尔物理学奖。,1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜(TEM)。,电子显微镜下的蚊子,Charles Oatl
3、ey,1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜(SEM)。,一、电子显微镜 近年来，电镜的研究和制造有了很大的发展。一方面，电镜的分辨率不断提高，透射电镜的点分辨率达到了0.2-0.3nm，晶格分辨率已经达到0.1nm左右，通过电镜，人们已经能直接观察到原子像；另一方面，除透射电镜外，还发展了多种电镜，如扫描电镜、分析电镜等。,1透射电镜（TEM）透射电镜即透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM），通常称作电子显微镜或电镜（EM），是使用最为广泛的一类电镜。,工作原理：在细胞生物学上，可用于观察和研究细
4、胞内部的亚显微镜结构、蛋白质、核酸等生物大分子的形态结构及病毒的形态结构。透射电子显微镜以电子枪作为照明光源，从电子枪灯丝发射的电子束经聚光镜会聚照射到样品上。带有样品结构信息的透射电子（transmission electrons，TE）进入成像系统，被各级成像透镜聚焦、放大后，投射在观察荧光屏上，形成透射电子显微镜像。主要优点：分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌。,透射电镜的结构： 主要由照明系统、样品室、成像系统、真空系统、观察与记录系统、电源及电器系统等六部分组成,根据加速电压的大小分为以下3种：（1）一般TEM。最常用的是100KV电镜。这种电镜
5、分辨率高（点0.3nm，晶格0.14nm），但穿透本领小，观察样品必须很薄，约为30100nm，如细胞和组织的超薄切片、复型膜和负染样品等。相当普及。我校有这样的设备。（2）高压TEM。目前常用的是200KV电镜。这种电镜对样品的穿透本领约为100KV电镜的1.6倍，可以在观察较厚样品时获得很好的分辨本领，从而可以对细胞结构进行三维观察。（3）超高压TEM。目前已有500KV、1000KV和3000KV的超高压TEM。这类电镜具有穿透本领强、辐射损伤小、可以配备环境样品室及进行各种动态观察等优点，分辨率也已达到或超过100KV电镜的水平。在超高压电镜上附加充气样品室，使人们可以观察活细胞内的超
6、微结构动态变化。,透射电镜下根尖细胞的亚显微结构,内质网透射电镜图,透射电镜下细胞内膜泡运输亚显微结构,2扫描电镜（SEM）扫描电镜即扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，简称SEM）。主要用于观察样品的表面形貌、割裂面结构、管腔内表面的结构等。,扫描电镜原理,工作原理：利用电子射线轰击样品表面，引起二次电子等信号的发射，经检测装置接收后成像的一类电镜。主要优点：景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物样品的各种形貌特征。,一些电镜图片,染色体 染色体 被精子包围的卵子,骨髓细胞 SARS AIDS,人类红细胞,酵母,人类精子,依据性能不同主要分为：（1
7、）一般SEM。目前一般扫描电镜采用热发射电子枪，分辨率为6nm左右，若采用六硼化镧电子枪，分辨率可提高到45nm。（2）场发射电子枪SEM。由于场发射电子枪具有亮度高、能量分散少，阴极源尺寸小等优点，这种电镜的分辨率已达到3nm。场发射电子枪SEM的另一个优点是可以在低加速电压下进行高分辨率观察，因此可以直接观察绝缘体而不发生充、放电现象。（3）生物用SEM。这种SEM备有冰冻冷热样品台，可把含水生物样品迅速冷冻并对冰冻样品进行观察，可以减少化学处理引起的人为变化，使观察样品更接近于自然状态。如要观察内部结构，还可用冷刀把样品进行切开，加温使冰升华，并在其上喷镀一层金属再进行观察，所有这些过程
8、都在SEM中不破坏真空的状态下进行。,3电子探针电子探针主要用于探测微小区域的元素成分。其原义仅是一个物理学名词，意指聚焦了的电子束。当电子束照射样品表面时，可激发X射线，X射线光量子的能量及波长与元素的原子序数有关，称为特征X射线。采用晶体分光光谱法测定X射线的波长和强度来分析样品成分的仪器，称为X射线分光光谱仪或电子探针；用锂漂移硅探头测定X射线能量和强度的仪器称为X射线能谱仪。,扫描隧道显微镜及原理,扫描隧道显微镜图片,硅表面 纳米算盘,由单个原子构成 的“IBM”,4分析电镜分析电镜是利用电子射线轰击样品所产生的X射线或俄歇电子对样品元素进行分析的一类电镜。其特点是能在观察超微结构的同
9、时，对样品中一个极微小的区域进行化学分析，从而在超微结构水平上测定各种细胞结构的化学成分及其变化规律。（1）分析TEM。在TEM上配备X射线能谱仪后即成为分析TEM，目前很多100KV和200KV TEM都可以装上X射线检测附件，进行样品的元素分析。（2）分析SEM。在SEM上配备X射线能谱仪后，便可兼有电子探针分析样品化学成分的功能。（3）扫描俄歇电镜。把SEM与俄歇电子能量分析仪相结合，即成为扫描俄歇电镜，它能对样品表面进行微区元素分析，是一种表面微观分析电镜。,5扫描透射电镜SEM中电子射线作用于样品后，其中一部分电子可透过样品成为透射电子，将透过样品的透射电子和散射电子用检测器接收成像
10、，即成为扫描透射电镜。这种电镜一般用场发射电子枪，兼有TEM、SEM和分析电镜的特点，能观察较厚的样品，分辨本领和成像质量都很好，是近年来电镜技术的最大改进之一。,二、电子显微术电镜具有很高的分辨本领，能观察极微小的结构。但是电镜不能直接观察天然状态下的生物标本，必须通过各种技术将生物标本制成特殊的电镜生物样品，才能放入电镜进行观察，这些电镜样品制备技术称为电子显微术。电子显微术：将生物标本制成特殊的电镜观察用生物样品的制备技术。,1与TEM有关的电子显微术（1）超薄切片技术。 超薄切片技术就是通过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤，将生物标本切成薄于0.1m的超薄切片的样品制备技术，用于生物
11、组织的内部超微结构研究。,玻璃刀制作仪,超薄切片机局部,（2）负染色技术。利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸铀等）将生物标本包围起来，增强背景散射电子的能力以提高反差，在黑暗的背景下显示标本的形态结构，称负染色技术。这一技术操作简便，主要用于颗粒状标本（如细菌、病毒、分离细胞器等）的研究。（3）冷冻蚀刻技术。在快速冷冻下对生物样品进行断裂、蚀刻和复型，制备生物样品复型膜的技术称冷冻蚀刻技术。在电镜下观察复型膜可获得立体感强的超微结构图像，主要用于生物膜结构的研究。,（4）电镜细胞化学技术。在超微结构水平上，通过电镜细胞化学反应来研究细胞成分的分布和变化的方法称电镜细胞化学技术。这
12、一技术把细胞超微结构与其化学组成有机地结合起来，目前主要用于研究细胞内各种大分子物质和酶的定位等。（5）免疫电镜技术。这是一种使抗原在超微结构水平上定位的技术，应用与抗原相应的标记抗体，在电镜下观察标记物的位置，从而定位相应抗原。这一技术具有灵敏度高、特异性强的特点。（6）电镜放射自显影技术。这是电镜技术与放射自显影技术相结合，观察放射性物质在超微结构水平上的定位和变化，从而了解细胞的各种代谢活动。这一技术使结构与功能的研究结合起来，是一种动态的研究方法。,2与SEM有关的电子显微术（1）SEM常规制样技术。SEM适合于研究生物样品的表面特征，样品制备包括样品观察面的暴露、固定、干燥和导电等步
13、骤，使表面特征充分暴露而不变形。这一技术是 SEM样品制备的常规技术，主要用于组织、细胞、寄生虫等表面形貌的研究。下图为SEM标本处理设备。,临界点干燥器 离子溅射仪,（2）生物标本割裂技术。将生物标本放在特殊包埋剂中经冷冻或其他方法固化，然后把固化的标本割裂，暴露组织和细胞的内部结构，再经干燥和导电后在 SEM下观察。这一技术使 SEM能观察生物标本的内部结构，目前最常用的是冷冻割裂技术。（3）铸型技术。用铸型技术（如甲基丙烯酸酯）注入生物体的腔性器官，制成铸型标本，可在SEM下观察管腔内表面的结构。目前最常用的是血管铸型技术，用以研究微小血管的分布和形貌。,作 业1.结合理论教学并查阅资料简述扫描电镜与透射电镜在原理、结构和应用方面的主要区别。 2.结合录像，简述超薄切片制备技术的主要过程。,
