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1、定量PCR原理、应用及数据分析,ZJW,原理:,PCR(多聚酶链式反应):一种体外扩增特异DNA片段的技术。反应分为变性(denaturation)、退火(annealing)、延伸(extension)三步。PCR扩增理论方程:,起点定量与终点定量:起点的DNA量为“天然”的含量,更有意义;终点的DNA量为经过PCR过程 “加工”的量,存在部分“失真”。(终点定量存在更大的误差),定量PCR:通过实时监测PCR每一个循环扩增产物相对应的荧光信号,来实现对起始模板进行定量或者定性的分析化学原理:荧光染料嵌合法, 探针法,SYBR Green I(不饱和型),Eva Green / LC Gre
2、en(饱和型),与dsDNA小沟部位嵌合,具有绿色激发波长。游离时不发光。缺点:需用melting curve检测产物特异性。,探针法:可用于多重PCR及基因分型 TaqMan 探针:检测积累荧光 一种寡核苷酸探针, 探针两端各锚定一个基团,淬灭剂则在3末端。,Taqman探针识别并结合特定的靶序列;探针完整时,报告基团R发出的荧光被淬灭基团Q吸收;在进行延伸反应时,Taq聚合酶的 5外切酶活性将探针切断, 使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。,基线:扩增曲线中的水平部分阈值(Threshold):指扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检
3、测界限。Ct值:从基数到指数增长的拐点所对应的循环次数,定量PCR数学原理,定量PCR技术的应用,定性分析:病毒病原菌检测、生物品种鉴定、SNP分析等、基因突变分析等绝对定量:基因拷贝数分析,病毒病原菌定量分析等相对定量:mRNA表达分析,siRNA表达分析等,定量PCR实验流程,引物、探针的设计与合成,定量PCR引物设计的要求: Tm=55-65 GC=30-80% PCR 扩增产物长度:引物的产物大小不要太大,一般在 80-300bp 之间都可。 引物的退火温度要高,一般要在 60以上。,内参基因的选择:内参:用于去除不同样本在RNA的产量、质量以及逆转录效率差异对目标基因表达的影响。稳定
4、表达于不同类型的组织和细胞中(如正常细胞和癌细胞),而且其表达量无显著差异;高度或中度表达,排除太高或太低表达;表达水平与细胞周期、细胞是否活化无关,且不受任何外源性和内源性因素的影响。,常见几种内参基因的优缺点:GAPDH:在不同癌组织(包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌)中表达升高,在不同个体间、妊娠期间以及细胞周期的不同阶段,以及多种因素刺激下(包括低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子等)表达存在差异;-actin:细胞恶性转化时表达水平增加;18S rRNA: rRNA合成的调节独立于mRNA。rRNA不包括Poly A尾,在以Oligo dT作为引物的cDNA合成中不能被转录。rRN
5、A高丰度表达,远高于目标基因,较其他内参基因稳定,且受RNA降解的影响比较小。,反应体系的配制 (25ul体系),熔解曲线,绝对定量:从荧光强度到拷贝数,相对定量的数据分析(2-Ct法/comparative Ct method),Livak, K. J et al. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) Method.,目标基因表达量(处理组/非处理组)的差异,Livak, K. J et al. Analysis of re
6、lative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) Method.,Livak, K. J et al. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) Method.,Livak, K. J et al. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) Method.,Thanks!,