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1、分类号 密 级U DC 单位代码 10733甘肃农业大学硕士学位论文鸭新城疫病毒HN蛋白原核表达及初步应用ProkaryoticExpressionandFirstApplicationofHNGeneofDuck-originNDV刘俊指导教师姓名 贾 宁 教授 （甘肃农业大学 兰州 730070）学科专业名称 基础兽医学 研究方向 兽医病理学论文答辩日期 2014年5月30日 学位授予日期 2014年6月答辩委员会主席 李克生 研究员评 阅 人 刘光远 研究员李剑勇 研究员2014年5月30日Classification No： Secrecylevel：ZeroUDC： Schoolco
2、de：10733GansuAgriculturalUniversityADissertationfortheMastersDegreeProkaryoticExpressionandFirstApplicationofHNGeneofDuck-originNDVPostgraduate:LiuJunSupervisor:Prof.JiaNingSpeciality:BasicVeterinaryMedicineResearchField:VeterinaryPathologySubmittedTime:June2014Address:Lanzhou,China,730070甘肃农业大学2014
3、届硕士学位论文I摘 要【目的】本研究利用Westernblot技术，对表达的HN蛋白进行免疫原性分析，并利用获得的可溶性纯化蛋白为初步构建鸭源NDV 抗体ELISA检测方法。【方法】(1)设计一对特异性引物用来扩增HN基因，将扩增出的 HN基因，克隆入原核表达载体pET-30a(+)。将成功克隆的重组质粒转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，诱导表达目的蛋白，利用Westernblot技术检测重组抗原的反应原性。将可溶性目的蛋白免疫成年短毛雄兔，制备（兔免血清）多克隆抗体。 (2)以纯化后的重组蛋白为包被抗原，棋盘方阵滴定试验摸索最佳工作条件，并根据100份健康鸭血确定阴阳性血清临界
4、值，建立鸭NDVELISA抗体检测方法。根据初步构建的间接ELISA方法，对江苏省泰州市某地区收集的部分鸭只进行新城疫病毒血清学检测。【结果】(1)在64KD左右处可见融合蛋白预期条带，并且形式存在为包涵体，Westernblot显示，在预期大小处有一条特异性条带，表明重组抗原具有良好的反应原性；(2)Westernblot证明制备的兔免血清多克隆抗体在对鸭源新城疫全病毒具有良好的特异性；(3)方阵滴定法，确定最佳工作条件为抗原包被液浓度：1000ng/well；血清最佳稀释度：1:500。根据100份健康鸭血确定阴阳性血清临界值为当待检血清OD4500.340时，确定为阳性；待检血清OD45
5、00.295时，确定为阴性。应用建立的间接ELISA方法对江苏省泰州市某地区收集的部分鸭只进行新城疫病毒血清学检测，阳性检出率为75%（84/116）。【结论】本研究将NDVHN基因成功克隆入pET-30a（+）载体，并优化融合蛋白表达量；制备了良好的兔免血清多克隆抗体；摸索出ELISA最佳工作条件，并根据阴性血清确定阴性和阳性血清临界值；建立了鸭源NDVELISA抗体技术检测，并在鸭NDV血清学技术诊断中得到了初步应用。关键词：鸭；NDV；HN基因；诱导；表达；ELISA甘肃农业大学2014届硕士学位论文IISummaryDuck-originND isanacuteandhighlycon
6、tagiousinfectiousdisease.Formerlywaterfowlhavestrongerresistancetocold,showedonlythepoison.Butinrecently,NDValsohadstrongpathogenicitytoducks,Ithasaseriousimpactonthebusinessofduck.InordertoestablishaELISAmethodtodetectantibodyagainstduck-originNDV,thisresearchinsertedtheHNgeneintotheprokaryoticvect
7、orpET-30a(+)andexpressedsuccessfully,BasedontheantigenicanalysisofHNprotein.Atthesametime,preparedrabbitantiserum.Specificmethodsasfollowings:(1)InsertedtheextensionofNDVHNgeneofduckwhichhasapairofspecificprimersintotheprokaryoticexpressionvectorpET-30a(+).Inducedandexpressedtheprotein,checkedbytheS
8、DS-PAGEandtheWesternblot.Useadultshorthairedmalerabbitsimmunizedwithrecombinantproteintopreparerabbitantiserum.(2)Thepurifiedrecombinantproteinascoatingantigen,establishedaELISAmethodtodetectantibodyagainstduck-originNDVbythemethodofchessboardtomadethebestworkingcondition.Usethebestworkingconditiont
9、omakesurethecriticalvalueaccordingtothe40healthyduckserum.ThenChecked116duckserumsamplesfromedemonstrationgardeninJiangsuprovinceTaizhoucity.(1)ResultoftheSDS-PAGEindicatesthatthefusionproteinwasvisibleexpectedbandsaround64KD,andexistsformofinclusionbody.TheproteincanberecognizedbyserumagainstNDV,Th
10、erecombinantHNproteinhasgoodimmunogenicity.WesternboltshowedPreparationofrabbitimmuneserumpolyclonalantibodyshowedgoodspecificityofduckoriginNewcastlediseasevirus.Chessboardmadesurethebestworkingconditionsfortheantigenconcentrationis1000ng/well,theoptimalserumdilution1:500.Inthebestworkingconditions
11、,in40healthyduckbloodandserumtodeterminethecriticalvalueofthetestedserumOD4500.340,judgedaspositive;whentestedserumOD4501.0，P/N 值较高，因此确定1h为阴阳性血清最佳作用时间。OD450 封闭液8%脱脂奶粉 5%脱脂奶粉 2.5%脱脂奶粉阳性血清 1.003 1.54 1.391阴性血清 0.396 0.473 0.524P/N 2.533 3.22256 2.655表3-2最佳包被液的选择Table3-2Thechoiceofcoatingbuffer表3-3最佳封闭
12、液的选择Table3-3Theeffectofdifferentblockingreagents(OD450nm)甘肃农业大学2014届硕士学位论文37血清 血清作用时间（h）1 2 3P 1.075 1.132 1.264N 0.097 0.104 0.136P/N 11.08 10.88 9.2942.5 酶标抗体最佳作用时间的确定血清 酶标二抗作用时间（h）1 2 3P 0.096 1.132 1.209N 0.085 0.097 0.113P/N 11.29 11.67 10.702.6ELISA临界值的确定及结果的判定间接ELISA测定100份健康鸭血，测出X为0.203、SD为0.
13、0459，X+3SD=0.340，X+2SD=0.295。则待测样品判定标准为OD4500.340，结果判定为阳性；待测样品OD4500.295，待检血清为阴性；0.340待测样品OD4500.295，判为可疑，需重复检验，如仍小于 0.340，则判为阴性。表3-4 血清最佳工作时间的选择Table3-4ELISAfordetectingtheoptimumreactiontimewithserum表3-5酶标二抗最佳工作时间的选择Table3-5ELISAfordetectingtheoptimumreactiontimeofsecondaryantibody甘肃农业大学2014届硕士学位论
14、文382.7重复性试验2.7.1批内重复性试验：取6份抗体水平各异的阳性血清在相同条件下进行ELISA试验，每份样品重复3次。主要观察平均数、标准差、变异系数几个指标。由表3-6可知，6份血清变异系数均在5.0%左右，最小值为4.87%,最大值为7.14%,均小于10%，表明该方法具有良好的重复性。重复数 各血清样本A B C D E F1 0.927 0.986 1.132 1.117 0.898 1.0382 0.978 0.924 1.129 0.976 0.935 0.9523 1.023 0.892 1.027 1.095 0.883 1.036XA=0.976，SDA=0.048，
15、CVA%=4.92%；XB=0.934，SDB=0.048，CVB%=5.12%；XC=1.096，SDC=0.060，CVC%=5.45%；XD=1.063，SDD=0.076，CVD%=7.14%；XE=0.905，SDE=0.027，CVE%=2.96%；XF=1.009，SDF=0.049，CVF%=4.87%2.7.2批间重复性试验：2.7.2.1不同批次重复性试验：在同一条件，制备1块ELISA板，在同一块酶标板内包被三份不同批次诱导纯化的抗原。取6份抗体水平各异的阳性血清，在相同条件下进行ELISA试验，每份样品重复3次。主要观察平均数、标准差、变异系数几个指标。由表3-7可知,
16、6份血清的变异系数均在5.0%左右，最小值为2.07%,最大值为5.06%,均小于10%，表明该方法具有良好的重复性。表3-6批内重复性实验结果Table3-6Theresultsofrepetitiontest甘肃农业大学2014届硕士学位论文39酶标板编号 各血清样本A B C D E F1 1.037 1.014 0.982 0.874 0.959 1.0042 0.987 0.973 0.993 0.927 0.981 1.0483 0.962 0.996 0.895 0.967 1.019 0.989XA=0.995，SDA=0.038，CVA%=3.84%；XB=0.994，SDB=0.021，CVB%=2.07%；XC=0.957，SDC=0.054，CVC%=5.61%；XD=0.923，SDD=0.047，CVD%=5.06%；XE=0.986，SDE=0.025，CVE%=2.51%；XF=1.014，SDF=0.031，CVF%=3.03%2.7.1.2不同时间重复性试验：在不同时间，
