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1、卫生健康体检肠道致病菌的检测,*前言*,根据我国食品卫生法第六章第二十六条的规定，食品生产经营人员必须每年进行健康检查，新参加和临时参加工作的也必须进行健康检查，取得健康证明后方可参加工作。根据我国公共场所卫生管理条例第二章第七条的规定，公共场所从业人员必须进行健康检查，取得健康证明后方可参加工作。凡患有痢疾、伤寒、病毒性肝炎等消化道传染病（包括病原携带者）是不得参加接触直接入口食品的工作，或者治愈前不得直接从事公共场所的服务工作。,概念,大便三线培养： 一般来说，广义的大便三线培养是指在医疗机构的肠道门诊中，日常进行的一些肠道致病菌的常规检测。主要包括：霍乱弧菌； 沙门菌、志贺菌、（大肠埃希
2、氏菌o157血清型）；副溶血弧菌；卫生健康体检中大便三线培养： 与上面相比，检测范围比较小，属于预防性体检，一般主要针对：霍乱弧菌；沙门菌；志贺菌；大肠埃希氏菌（o157血清型）,*肠杆菌科*,是一大群寄居在人和动物肠道中的生物学性状相似的G-无芽胞的短小杆菌，其中4类常引起腹泻和肠道感染（埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、耶尔森菌属）；8类常导致院内感染的条件致病菌（枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属）形态、培养、生化特征： G-杆状或球杆菌，无芽胞，多有鞭毛，能运动，致病性菌株多数有菌毛，多数具有F、R、COL等质粒，需氧或兼性厌氧，在普
3、通和MAC培养基上生长良好，在液体培养基内均匀混浊生长； 发酵葡萄糖，产酸或产酸产气，氧化酶阴性，触酶阳性，硝酸盐还原试验阳性；多年来乳糖发酵试验是区分致病性和非致病性肠杆菌科细菌的重要依据；,*肠杆菌科*,抗原构造： O抗原：是细胞壁的成分，为脂多糖（LPS），具有属、种特异性，以核心多糖为分子的中心，内侧是类脂A，为内毒素的毒性处，外侧是由重复的低聚糖组成的多糖链，决定O抗原的特异性； H抗原：是不耐热的蛋白质抗原，由鞭毛蛋白多肽链上的氨基酸序列和空间构型决定H抗原的特异性； 表面抗原：是包绕在O抗原外侧的不耐热的多糖抗原，由黏液或荚膜多糖的结构决定表面抗原的特异性，在不同的菌属中表面抗原
4、有不同的专有名称，如大肠埃希菌属的K抗原、沙门菌属的Vi抗原、志贺菌属的B抗原等；变异性：主要有S-R变异、H-O变异,*沙门菌*,定义：是一群寄居于人类和动物肠道中，生化反应与抗原结构相关的革兰氏阴性杆菌，多数对动物致病，仅少数引起人类疾病，如导致肠热症的伤寒、甲副、肖氏、希氏沙门氏菌等。有些动物沙门氏菌也可传染给人类，引起食物中毒或败血症，如鼠伤寒沙门氏菌。形态和培养特性： 1、G-细长杆菌，有鞭毛和菌毛（除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌），一般无荚膜，均无芽胞。 2、需氧或兼性厌氧，最适温度37，PH7.27.4，对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37 ，24h，能形成菌落中等大小，直径23
5、mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落。 3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。,*沙门菌*,生化特征： 1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气） 2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金黄花醇 3、多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（VP）（-） 4、能还原硝酸盐为亚硝酸盐（+），动力阳性（+） 5、在KCN培养基中生长（-），苯丙氨酸脱羧酶（-）,*沙门菌*,*沙门菌*,抗原结构（血清型）： 1、O (菌体)抗原 是细胞壁上的脂多糖（LPS），性质稳定，耐湿热100数小时，不被酒精或0.1%石炭酸破坏，用
6、阿拉伯数字1，2，3表示，目前发现有58种。将相同抗原组分的划归一组，称为群。 沙门氏菌中的主要菌群及其群特异性抗原 A群 O2 C群 O6 C1亚群 O6、 O7 C2亚群 O6、O8 B群 O4 D群 O9 F群 O11 E群 O3 E2亚群 O3、O10族 E3亚群O3、O15 E4亚群 O1、O3、O19,*沙门菌*,2、H（鞭毛）抗原 为蛋白质，性质不稳定，不耐热，湿热6015分钟或酒精处理即破坏。可分为相和相。其中相特异性高，故又称特异相，以a、b、c、d表示； 相特意性低,故又称为非特意相,以1、2、3、4表示。同时有相和相H抗原的称为双相菌，仅有一相者为单相菌。 3、Vi(表面
7、)抗原 化学成分为不耐热的聚-N-乙酸-D-半乳糖胺糖醛酸，不稳定，经6030分钟、石炭酸处理或传代培养后易消失。它是菌体表面抗原，有抗吞噬、抗补体的作用。 4、菌毛抗原,*沙门菌*,临床意义： 1、致病物质：侵袭力、内毒素、肠毒素 2、所致疾病：肠热症（伤寒）、胃肠炎（食物中毒）、败血症（多见于儿童和免疫力低下的人）、无症状带菌者 3、免疫性：是细菌胞内寄生微生物，人体仅主要靠细胞免疫 4、抵抗力：对湿热敏感，65，1520分钟灭活，水中存活23周，粪便中存活12个月，在冰冻土壤中越冬，5%石炭酸5分钟可杀死，对某些染料有一定耐受（SS平板）。,*志贺菌*,定义：是肠道中主要的病原菌之一，导
8、致人类细菌性痢疾的革兰氏阴性短小杆菌。可分为4个群，痢疾志贺氏（A群），福氏志贺氏（B群），鲍氏志贺氏（C群），宋内氏志贺氏（D群），我国以B群最多见，占70%以上，其次为D群和A群。形态和培养特性： 1、G-短小杆菌，无鞭毛，有菌毛，一般无荚膜，均无芽胞，胞质内有两种质粒，与侵袭力和耐药性相关。 2、需氧或兼性厌氧，最适温度37，PH7.27.4，对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37 ，24h，能形成菌落中等大小，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落。 3、在液体培养基中，呈均匀混浊性生长，无菌膜。,*志贺菌*,*志贺菌*,生化特征： 1、发酵GLU，产酸不产气，分解甘露醇（除A群
9、外） 2、不发酵乳糖，（宋内氏迟缓发酵，48小时），不发酵蔗糖 3、不产生H2S（-），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（VP）（-） 4、甲基红试验阴性（-） 5、动力阴性（-）,*志贺菌*,根据生化反应和O抗原差异，分成4个血清群和44个血清型 1、A群：痢疾，不分解甘露醇，有10个血清型 2、B群：福氏，有15个血清型，我国以2a、1b、3型居多 3、C群：鲍氏，有18个血清型 4、D群：宋内氏，迟缓发酵乳糖，只有1个血清型，但分为S和R型两种菌落，其诊断因子血清无交叉凝集现象,*志贺氏菌*,临床意义： 1、致病物质：侵袭力、内毒素、外毒素（痢疾志贺氏产生，包括肠毒
10、素、细胞毒素和神经毒素） 2、所致疾病：急性菌痢、慢性菌痢（治疗不彻底造成的反复发作）、无症状带菌者 3、免役性：人体主要靠肠道局部免疫 4、抵抗力：对理化因素的抵抗力较弱，对酸敏感，对湿热敏感，5060，10分钟灭活，日光照射30分钟灭活，1%石炭酸1530分钟可杀死，容易发生SR和耐药性变异，耐药性主要由R质粒决定，可在细菌间传播。,*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）,采样（湿润的10CM棉签、肛拭） S.F增菌液10ml（37、1824小时） GN增菌液10ml（37、46小时） S.S平板划线分离培养（37、1824小时） 无可疑菌落报告 观察、挑选可疑菌落接种KIA或双糖铁 （37、
11、1824小时） 初步鉴定，根据结果做氧化酶试验等 全面生化反应实验 血清学鉴定（多价诊断血清） 报告结果,*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）,*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）,沙门氏菌在KIA或双糖铁上的生长情况： 斜面产碱鲜红色/底层产酸黄色，有少量产气或不产气，H2S阳性有显黑色（A K + +）,动力阳性（沿穿刺线蔓延生长）志贺氏菌在KIA或双糖铁上的生长情况： 斜面产碱鲜红色/底层产酸黄色，不产气， H2S阴性无显黑色（A K - -） ，动力阴性（只沿穿刺线生长）,*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）,三糖铁斜面高层培养现象,2志贺氏菌3沙门氏菌4大肠杆菌,*检测和鉴定程序（沙门氏、
12、志贺氏）,半固体琼脂培养现象,*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）,沙门氏菌血清学分型： 1、先A-F多价混合诊断血清进行玻片凝集; 2、再单价抗O因子诊断血清进行玻片凝集; O4因子血清 B群 O9因子血清 D群 O3因子血清 E群 O11因子血清 F群 O2因子血清 A群 O6因子血清 C群 3、最后H单价抗原血清进行玻片凝集;,*检测和鉴定程序（沙门氏、志贺氏）,志贺氏菌血清学分型： 1、用4种志贺氏菌多价血清，如果由于表面抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再进行玻片凝集试验; 2、用A1，A2，B群多价，C群多价，D群诊断血清分别试验; 3、依次选用型因子血清分别进行试验;,有关配制
13、培养基的补充:,从业人员体检大便三线培养基本要求*相关物品的准备*1、仪器设备 恒温培养箱 干燥箱 高压灭菌器 显微镜 接种环2、培养基 SS琼脂 4号琼脂(必须用9cm玻离平皿) SF和GN增菌液 碱性胨水 KIA或双糖铁3、诊断血清 沙门氏多价 志贺氏多价 霍乱多价,有关配制培养基的补充:,检验要求及报告1. 检验标本必须增菌或直接接种平板进行，增菌后再次接种平板，碱性胨水增菌液必须保存到阴性报告发出后。2. 疑似霍乱菌株必须在18-24h内报县疾控中心。 3. 其他疑似菌株就近送县级医院或县疾控中心。,有关配制培养基的补充:,1、配制S.F和GN增菌液时，玻璃试管分装量一般为10ml支，
14、否则增菌效果不明显；2、由于S.F中的主要成分为亚硒酸，遇高温会还原成硒酸，失去抑制杂菌的作用，故采用先把干净的玻璃空试管加硅胶塞，高压灭菌，121，1520分钟，再把S.F增菌液干粉培养基按比例要求加热彻底溶解，后采用无菌手法分装；贴上配制时间的标签，放冰箱冷藏，一般为28 ，可以保质1个月左右；但是要随时观察，如果发现试管底部有红色沉淀，说明增菌液长杂菌变质，需重新配制新的增菌液；同时，干粉培养基也应放冰箱储存；3、最好用直径9cm的玻璃平皿配制SS平板，厚度为23 mm，估计400ml的培养基倾倒23个平皿，贴上配制时间的标签，放冰箱储存，一般为28；4、KIA或双糖铁配制时，干粉培养基应彻底充分溶解，否则分装后每支斜面高层内含琼脂量不均匀；由于其中含糖成分，高压灭菌温度不能太高， 110，1015分钟；所制成的高层斜面应该规范，保留1cm的垂直高度；,
