《雌激素激活gper-egfr-erk 通路促进人乳腺癌skbr-3 细胞系增殖》由会员分享，可在线阅读，更多相关《雌激素激活gper-egfr-erk 通路促进人乳腺癌skbr-3 细胞系增殖（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Comment h1: 应和方法相对应。注意表述时的归纳总结，并突出实验组的结果；要把做过统计学分析得出主要结论的数据和统计学结果全部写入，请添加，英文也注意一致；我加入了部分结论数据，如有不妥还请给出修改意见.雌激素激活 GPER-EGFR-ERK通路促进人乳腺癌 SKBR-3细胞系增殖李维东，罗浩军，李振华，余腾华， 杨光伦，涂 刚 （400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科）摘要 目的 探讨 G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor,GPER）介导雌激素对人乳癌细胞系 SKBR-3增殖的影响。方法 激光共聚焦显微镜扫描
2、检测钙离子探针标记的细胞内钙离子浓度随时间的变化，CCK-8 法观察测量细胞的增殖生长，流式细胞术检测细胞周期，Western blot 检测磷酸化细胞外信号调节激酶（phospho-extracellular regulate ekinase，p-ERK）的相对表达量。 结果 17-雌二醇（E 2）与 GPER激动剂（G1）刺激 SKBR-3细胞后，细胞内钙离子浓度从 120s开始迅速升高，细胞增殖与对照组相比显著增加，CCK-8测定的相对细胞数分别是对照组的（2.080.07）倍和（2.00.04 ）倍 ，流式细胞术检测细胞 S期及 G2M 期即增殖指数 PI（43.12%0.38%,42
3、.43%0.52%）较对照组（29.19%0.29%）增加（ P0.05）,Western blot 显示 p-ERK表达量在 E2作用组显著高于对照组（ P0.05） 。GPER 特异性抑制剂 G15 、EGFR 拮抗剂 AG1478、ERK 拮抗剂U0126均可抑制 E2、G1 触发的相应变化，PI3K 拮抗剂 WM则不能。结论 雌激素激活 GPER-EGFR-ERK通路促进人乳腺癌 SKBR-3细胞系增殖。关键词 雌激素；GPER ；SKBR-3；增殖 中图法分类号 R737.9 文献标志码 A Estrogen activatesGPER-EGFR-ERK pathway to pro
4、mote the proliferation of human SKBR-3 breast cancer cell line Li Weidong，Luo Haojun，Li Zhenghua，Yu Tenghua，Yang Guanglun，Tu Gang（Department of Endocrine Breast Surgery,First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing,400016）Abstract Objective To explore the effect of G protein coupl
5、ing estrogen receptor (G protein-coupled estrogen receptor, GPER) induced by estrogen on the proliferation in human SKBR-3 breast cancer cell line. Methods Calcium influx, cell growth ability and cell cycles were checked by confocal laser scanning microscopy, CCK-8 assay and flow cytometry in the pr
6、esence of different drug treatment, respectively. Relative expression levels of extracellular signal regulating kinase phosphorylation (Phospho-extracellular regulated kinase, p-ERK) was detected by immune-blotting. Results After treatment of 17- estradiol (E2) or GFER specific agonist (G1), inner c
7、ells calcium ion concentration was shifted quickly starting from 120 seconds;cell proliferation was increased significantly, CCK-8 assay relative cell number were（2.080.07）times and（2.00.04）times respectively compared to control group; proliferation index (PI) （43.12%0.38%,42.43%0.52%） in S phase an
8、d G2-M phase was increased dramatically compared to control group （29.19%0.29%）(P0.05); the protein level of p-ERK was much higher than that in control group (P0.05). GFPE antagonist G15 、EGFR antagonist AG1478 and ERK antagonist U0126 can inhibit the changes which induced by E2 or G1,but not the PI
9、3K antagonist WM. Conclusion Estrogen activatesGPER-EGFR-ERK pathway to promote the proliferation of human SKBR-3 breast cancer cell line.Key words estrogen ；GPER ； SKBR-3 ； proliferationSupported by the General Program of National Natural Science Foundation of China(30872520,81072149).Corresponding
10、 author：Tu Gang，Tel ：86-23-89011191，E-mail： Comment h2: 核对是否有误？原稿缺受体与英文全称？对，应该是表皮生长因子受体.基金项目 国家自然科学基金面上项目（30872520,81072149）通信作者 涂 刚，电话：（023）89011191，E-mail：雌激素通过雌激素受体（estrogen receptor，ER）在乳腺癌发生、发展中发挥重要作用。雌激素 G蛋白偶联受体（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）作为新的雌激素膜受体，通过反式激活表皮生长因子受体（epidermal growt
11、h factor receptor, EGFR）等信号通路产生快速的非基因性雌激素效应，作用方式与 ER、ER 显著不同。研究表明 GPER可以调控多种雌激素相关癌细胞的生长，如子宫内膜癌细胞、卵巢癌细胞、甲状腺癌细胞等 1-3，且在乳腺癌细胞系和原发性乳腺癌组织中均有广泛表达。本研究利用 GPER特异性激动剂 G14及 GPER特异性拮抗剂 G155等小分子化合物探讨 GPER对 GPER高表达而 ER、ER不表达的 SKBR-3细胞系的生长增殖的影响及其分子机制。1 材料与方法1.1 材料SKBR-3细胞系购自中国科学院上海细胞库、无酚红高糖 DMEM培养基（Hyclone） 、胎牛血清（
12、Hyclone） 、GPER特异性激动剂 G1及其拮抗剂 G15（Sigma） 、17- 雌二醇（E 2） （Sigma） 、CCK-8 试剂盒（碧云天） 、Fluo-3AM（钙离子荧光探针） （S1056，碧云天） 、 PI3K拮抗剂 WM、EGFR拮抗剂 AG1478、ERK 拮抗剂 U0126均购自 MILLIPORE公司、p-ERK 抗体（BS5016 ，Bioworld Technology,Inc.） 、ERK抗体（BS1112， Bioworld Technology,Inc.） 、山羊抗兔 IgG抗体（Bioworld Technology,Inc.） 。二氧化碳培养箱（The
13、rmo Forma） 、多功能酶标仪（Spectrax M2） 、Bio-RAD凝胶成像仪（Molecular Imager） 。1.2 方法1.2.1 细胞培养 SKBR-3细胞在含 10%胎牛血清的无酚红高糖 DMEM培养基、37、5% CO2培养箱内培养，当单层细胞长至 80%90%时用 0.25%胰酶消化细胞以 610 5/ml的细胞浓度传代，同时换新的培养基。1.2.2 激光共聚焦检测细胞内相对 Ca2+浓度 取对数期细胞胰酶消化后接种于共聚焦平皿中，24 h后用含钙离子探针Fluo-3AM（5 mol/L）的培养基在 37孵育 60 min，PBS 洗2次后加无血清无酚红 DMEM
14、培养基 37孵育 30 min。在488 nm的激发波长下用激光共聚焦显微镜连续扫描（3 s/帧）细胞内荧光，前 5帧扫描获得基线值，后加入相应药物，观察药物对细胞内钙离子浓度的影响。G15E 2、G15G1 处理组在扫描前 15 min加入拮抗剂 G15、G1、E 2、G15 的浓度 6-7分别为 1、100、1 mol/L。实验重复 3次。1.2.3 CCK-8法测定不同处理因素对 SKBR-3细胞系生长增殖的影响 取对数生长期细胞胰酶消化后以每 100l含 10% FBS的无酚红 DMEM培养基中 3 000个细胞的浓度种于 96孔板，每孔种 100l上述细胞悬液。待细胞完全贴壁后，中加
15、入相应药物处理，含 GPER拮抗剂 G15、EGFR 拮抗剂 AG1478 、ERK 拮抗剂 U0126、PI3K 拮抗剂 WM处理组提前 15min加入相应拮抗剂。最后每孔中 G1、E 2、G15、AG1478、U0126、WM的浓度 6-8分别为 1、100、1、10、10、10 mol/L，空白调零组不种细胞只加培养基，每组设 5个复孔。各组将 DMSO的量调整至一样（各药物均用 DMSO稀释） 。连续培养 5 d后，每孔加入 10l CCK-8试剂置于 37、5% CO2培养箱中孵育 2 h，酶标仪测定各孔光密度值（测定波长 450 nm） 。重复 3次实验，绘制细胞生长曲线。1.2.
16、4 细胞周期分析 取对数生长期 SKBR-3细胞系胰酶消化后以 2105/ml种于 6孔板，用含 10%胎牛血清无酚红DMEM培养基培养于 37、CO 2 5%培养箱，24 h后移去培养基，PBS 洗 2次，各孔加入无血清无酚红 DMEM培养基 2 ml饥饿 24 h使细胞同步于 G1/G0期。弃去培养基，PBS 洗 2次，各孔加入含 10%胎牛血清无酚红 DMEM培养基 2 ml，各组加入相应药物（浓度同上） ，各孔调整 DMSO量至相同，24 h后收获细胞，70%乙醇固定，置于 4冰箱过夜，PI 染色避光室温孵育 30 min，流式细胞仪检测各组细胞 DNA含量。实验重复 3次。1.2.5 Western blot检测磷
