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1、用 Furo-3/AM 检测细胞内钙离子浓度FSC forward scatter 480nmSSC side scatter 480nmFL1 515-545nm 绿色FL2 564-606nm 橙色FL3 650- 红色1, 实验目的：检测不同细胞株中细胞质内钙离子浓度的差异，以检测钙离子浓度对癌细胞的迁移性的影响。1， 检测迁移性不同的 FBJ-LL-H 于 S1-H 两株细胞中细胞内钙离子浓度的差异。2， 检测间质作用因子 Stim1 对细胞内钙离子浓度的影响 包括对照组细胞，Stim1 表达的几株单克隆细胞3， 观察细胞 ER 钙离子释放之后的钙离子内流2, 样品处理：1. 储备液配
2、制F-127 5mg + 25uL DMSO 终浓度 20% 0.05mg Fluo-3/AM +22uL DMSOF127 与 Fluo-3/AM 以体积比 1 比 1 混合 终浓度为 2 M2. 消化细胞3*10e6/mL-1*10e7/mL 细胞混悬液加入 Fluo-3/AM，使之终浓度为 4 M3. 避光 37 45min4. PBS(-)清洗 2 遍5. 用 PBS(-)重悬细胞，将浓度定为 1*10e6/mL6. 当用毒胡萝卜素 Thapsigargin（TG ）排空细胞内质网钙池钙离子时, 用终浓度为 3 M的 TG 孵育 15min， 上样 20 s 后加入钙离子使其终浓度为
3、1 M 观察钙离子内流7, 为观察细胞在加入 TG 之后胞内钙离子的变化，将未经 TG 处理的细胞上样 20s 后加入TG 观察钙离子浓度变化，正常情况下 TG 加入后因为钙池钙离子的释放胞内钙离子浓度会有一个上升的过程，随后因为钙泵失效，钙离子会逐渐降低。流式细胞仪Coulter 图横轴 时间 time 纵轴 荧光强度（FL1）取 400uL 混悬液， （40-秒 baseline monitoring？）上样持续检测 1-3min 激发光波长 488nm 发射波长 530nm数据处理 CellQuest software实验原理：Fluo-3-Am 进入细胞后经非特异性酯酶脱去 Am 酯，
4、成为脂溶的 Fluo-3 留在细胞内，当 Fluo-3 与细胞内游离钙结合后，其荧光强度是 Fluo-3 本身的 40 倍以上，当用480nm 波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。参考文献中的检测方法：1. CCL19 和 CCL21 能激活钙内流，细胞内高表达当 CCR7 变异形式 MT1 或者 DNY时，钙离子内流被阻止。用钙离子载体 ionmycin 作为阳性对照。样品处理Furo-3/AM 储备液配成 4mM，最终以 1.5uL/mL 加入 10e6/mL 的细胞混悬液中，37孵育 30min，将其分成不同的组分并加入不同的激动剂 CCL19，CCL21，ionomycin
5、，持续检测钙离子浓度 150 秒。HEPEs buffer260.32. mSDF-154 不含 a 螺旋尾巴的 mSDF 变异，细胞内加入 mSDF 多肽能引起钙离子内流，而不含 a 螺旋的 mSDF 变异能阻止其功能。实验方法：5*10e9/L 细胞中加入 Furo-3/AM 终浓度 4uM， 室温避光孵育 45min，用不含酚红 RPMI培养基，加入 SDFWT 或 SDFmt，孵育 15min 后上样检测。3mSDF 含 a 螺旋于不含 a 螺旋引起不同的钙离子内流样品处理;10e7 细胞悬浮于钙离子分析缓冲液中，加入 fluo-3/am 使其终浓度为 4uM，室温孵育45min，用缓冲液清洗 3 次，重悬于缓冲液中暗室放置备用。每个样品做一个 40s 的基准线调试（basement monitoring？）片刻后快速加入 SDF-WT 和 SDFmt，检测钙离子浓度。
