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1、1胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的生物学特性的比较【摘要】 目的 探讨人胎盘、脐血和骨髓来源的贴壁细胞的分离培养和生物学特性，为间充质干细胞(MSC)的选择和应用提供依据。方法 采用酶消化法分离人胎盘组织，60g/L 羟乙基淀粉和密度梯度离心两步法分离脐血单个核细胞，密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，分别进行贴壁培养，观察不同来源 MSC 的生长、增殖和表面标志的表达并做比较。结果 胎盘来源的贴壁细胞为一种混合性细胞，脐血单个核细胞体外培养可以获得形态不均一的贴壁细胞，二者在生长规律和形态学特征上与骨髓基质相比有一定差异性，CD106、CD44 在三种细胞均有表达。结论 胎盘和脐血来源的贴壁细
2、胞具备间充质干细胞的基本特征。 【关键词】 胎盘；脐血；间充质干细胞Comparison of the adherent cells derived from human placenta,umbilical cord blood and bone marrowABSTRACT: Objective To compare the adherent cells derived from human placenta, umbilical cord blood and bone marrow, and provide laboratory data for clinical application
3、 2of mesenchymal stem cells. Methods Adherent cells were isolated from human placenta tissues by enzyme digestion, and mononuclear cells (MNC) were isolated from umbilical cord blood (UCB) by 60g/L HES and density gradient centrifugation and MNC were isolated from bone marrow (BM) by density gradien
4、t centrifugation, and then these cells were cultured in vitro. Their biological characteristics were studied and compared. Results The adherent cells cultured from human placenta and umbilical cord blood had disparate shape in vitro respectively. And they had some differences in growth and shape fro
5、m those derived from bone marrow. The adherent cells derived from the three tissues all expressed CD106 and CD44 in immunohistochemistry staining. Conclusion The adherent cells derived from human placenta and umbilical cord blood have the basic features of mesenchymal stem cells.KEY WORDS: placenta;
6、 umbilical cord blood; mesenchymal stem cell间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是成体干细胞之一，不仅支持造血系统，还具有多向分化潜能，在一定的实验条3件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞、心肌细胞、肝细胞等15 。因此，在细胞微环境和组织工程等方面具有广泛的应用前景。近年来，已有具有干/祖细胞特征的间充质细胞自骨髓、外周血、软骨、肌肉等组织中分离出来。这些组织均来源于胚胎发育期的中胚层，胎盘由滋养细胞及大量起源于中胚层的间充质和血管共同组成，亦有报道从脐带中分离培养出间充质干细胞67 。因此，提
7、示我们，与脐带同为胎儿附属物的胎盘中可能也含有 MSC。本实验试从胎盘和脐血中培养出类似于骨髓来源的间充质干细胞的贴壁细胞，并对这三种细胞进行形态学观察，利用免疫细胞化学方法对其进行表面抗原的测定和比较，探讨其作为 MSC新来源的可行性。1 材料与方法1.1 材料 胎盘、脐血均采自本院产房。供者要求是身体健康的产妇，胎儿发育良好。新鲜骨髓标本采自本院门诊营养性贫血(骨髓呈增生象)患者。二氧化碳培养箱系美国谢尔登有限公司产品；SHELLAB1815TC 型、胰蛋白酶、胶原酶、DNase酶系 Sigma公司产品；牛血清白蛋白(BSA) 系 Roche 公司产品；胎牛血清(FBS)系杭州四季青生物工
8、程材料有限公司产品；LDMEM 为 GIBCO 公司产品；小鼠抗人 CD34、CD45 单克隆抗体，兔抗人CD44、CD106 多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供。41.2 胎盘、骨髓来源贴壁细胞的分离培养 在无菌条件下，剪取新鲜胎盘蜕膜层与羊膜层之间的绒毛组织，用含肝素的 PBS 反复冲洗，去除其血液成分。将绒毛膜层组织剪碎至约1mm1mm1mm 大小，并尽可能去除肉眼可见的小血管及纤维连接成分，加入含 2.5g/L 胰蛋白酶、1g/L 胶原酶、0.1g/L DNase酶的 LDMEM，于 37恒温摇床内消化 30min。消化产物经 200 目无菌金属滤网过滤，去除未消化的组织。过滤
9、后的细胞悬液用 PBS 洗 2 次，然后进行细胞计数。骨髓液经 Ficoll 密度梯度离心法分离单个核细胞并计数。脐血经 60g/L 羟乙基淀粉和 Ficoll密度梯度离心两步法分离出单个核细胞并计数。以上三种来源的细胞计数后均用含 100mL/L 胎牛血清的LDMEM，在 37、 50mL/L CO2 和饱和湿度下培养。贴壁 24-48h 后，换液去除悬浮细胞。继续培养，每 3-4d 换液 1 次。待细胞 80%-90%融合后，胰酶消化传代。取 3 代以上传代细胞部分用于细胞化学染色，部分细胞液氮冻存备用，余者用于继续传代和诱导实验。1.3 细胞诱导分化及染色 上述三种来源的原代贴壁细胞和传
10、代细胞经胰酶消化后，分别接种于预放置有消毒无菌盖玻片(用于制备细胞爬片)的 12 孔板内培养，加入成骨诱导剂(地塞米松、 磷酸5甘油、抗坏血酸，终浓度分别为 10-8mol/L、10mmol/L、50mg/L) 进行诱导分化，同时设置对照(仅含培养基)，每 3d 换液 1 次。分别逐日进行观察，细胞爬片用于细胞化学染色。1.4 观察指标及鉴定 倒置显微镜下观察原代及传代细胞生长、增殖的形态特征、分布及形成时间。贴壁细胞的鉴定：细胞组织化学按文献8方法操作。取细胞载片，行瑞氏染色、非特异性酯酶(NSE)染色、过氧化物酶(POX)染色、糖原(PAS)染色和碱性磷酸酶 (ALP)染色，光镜镜检。免疫
11、组化染色按文献1方法操作。取培养细胞载片行CD34、CD106、CD44、CD45 等指标检测，显微镜下计数 100 个贴壁细胞，计算阳性率。2 结果2.1 MNC 的分离培养 5 份骨髓标本和 9 份胎盘组织分离培养后均获得了贴壁细胞。分离了 7 份正常脐血标本，平均获得MNC(1.551.15)108 个，有 4 份获得了贴壁细胞，获得率为57.1%。62.2 贴壁细胞的形态特征 胎盘细胞刚分离时，细胞大小不均一，以单核的细胞为主，多核的细胞较少(图 1A)。培养 2-4d 出现纤维样细胞，多核细胞大多融合或出现核固缩。约需 1-2 周左右，镜下可见贴壁细胞呈多样性。待培养 3 周后可见致
12、密的贴壁细胞层。细胞形态由早期混合形态逐渐变为相对均一的梭形。细胞接近融合时呈条索状，集落中的细胞排列呈漩涡状或辐射状(图 1B)，且贴壁牢、增长速度较快，用 2.5g/L 胰蛋白酶消化需要 5-10min，传代后形态无明显改变，最多可以传 10 代。脐血 MNC 接种时细胞呈圆形，第 3-5 天始出现贴壁细胞，第 7 天换液去除未贴壁细胞后观察，获得的贴壁细胞形态表现不均一，在少量的纤维样细胞周围混杂有大量的破骨样细胞，大小不一，边缘光滑，出现多核，胞核大且清晰；纤维样细胞出现较少，呈梭形，胞内常含有空泡和(或) 颗粒，散在存在( 图 2A)。培养大约 14-22d 纤维样细胞增多占大多数，
13、主要表现细胞体积增大，但并不融合(图 2B)。脐血 MNC 中获得的贴壁细胞不易被胰蛋白酶消化，时间较长，以 2.5g/L 胰蛋白酶消化超过 10min，传代后生长缓慢最多可传 2 代，细胞无法继续增殖。骨髓 MNC 培养第 2-3 天出现贴壁细胞，约 2-4d 后出现纤维样细胞，形态均一，第 5-6 天后可见散在分布的典型的纤维样细胞克隆，第 7 天换液时部分细胞出现融合，增殖迅速，第 13-17 天7细胞接近 90%融合，集落中的细胞排列有一定方向性，呈漩涡状或辐射状。培养 2 周细胞可传代， 1.25g/L 胰酶消化时间为 3-5min，传代后 6h 即可贴壁，形态与原代相似，长梭形，生
14、长迅速，约 3-4d 左右达到 90%融合，进行传代，最多可以传 14 代，细胞形态并无明显变化，但增殖速度已明显减慢。2.3 细胞化学染色 三种不同来源的贴壁细胞 POX 染色均为阴性，PAS 染色均为阳性；脐血来源的贴壁细胞 ALP 染色阳性率为20%，其 NSE 染色也较其他两种来源者阳性率高(表 1)。表 1 不同来源的贴壁细胞的组织化学染色结果（略）Table 1 Histochemical staining of the adherent cells derived from different tissuesPOX: peroxidase; PAS: periodic acids
15、chiff; ALP: alkaline phosphatase; NSE: nonspecific esterase2.4 免疫细胞化学染色 三种不同来源的贴壁细胞CD44、CD106 染色均为阳性(图 3)，CD34、CD45 染色均为阴性(表 2)。82.5 贴壁细胞向成骨细胞的诱导分化 胎盘和脐血来源的贴壁细胞经地塞米松诱导向成骨细胞转化后，形态并无明显变化，碱性磷酸酶染色呈强阳性。骨髓 MNC 向成骨细胞转化后，细胞形态发生很大改变。加入诱导物后的第 7 天，胞体增大，多角形细胞增多，第 14 天大部分的细胞成为多角形；诱导后的细胞 ALP 表达明显增加，大部分的多角形细胞呈强阳性反
16、应，梭形细胞染色略弱。图 1 胎盘来源的原代贴壁细胞（略）Fig.1 Isolation and morphology of placentaderived primary adherent cellsA: Just isolation (200); B: 3 weeks after isolation (40)图 2 脐血来源的原代贴壁细胞（略）Fig.2 Isolation and morphology of primary adherent cells derived from umbilical cord bloodA: 7 days after isolation (40); B: 3 weeks after isolation (40)图 3 脐血来源的贴壁细胞的免疫细胞化学染色（略）9Fig.3 Immunohistochemical staining of the adherent cells derived
