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1、产碱性磷酸酶菌株的分离,1.碱性磷酸酶简介2.设计原理3.实验材料4.设计思路5.实验步骤,碱性磷酸酶简介：,碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase， EC 3.1.3.1，简称AP ）是一种底物专一性较低的非特异性磷酸单酯酶，几乎能催化所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相对应的醇 酚或糖 AP被广泛用于分子生物学研究 医学临床检验 食品检验 化妆品制造 环境毒物检测及有机磷农药降解中,实验设计原理：,目前应用较广的是牛小肠碱性磷酸酶和E.coli碱性磷酸酶4。但因产率低、热稳定性差，价格昂贵等问题，使其的大量使用受到了限制。本实验通过微孔板法初筛，磷酸苯二纳法测酶活复筛的
2、方法来阐述对产碱性磷酸酶菌株的分离。,材料：,试剂：(l)0.lmol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0)称取无水碳酸钠0.649、碳酸氢钠、3.49、4一氨基安替比林0.159,定溶于100ml蒸馏水中。(2)0.02mol/L磷酸苯二钠溶液称取二水磷酸苯二纳0.519,使其定容于100ml沸水中,冷却后加入0.sml的氯仿。置冰箱保存。(3)铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.259、硼酸1.79,各溶于40ml水中,二液体混合后定容至10枷1。置冰箱保存。以上试剂置冰箱保存一般不超过一周,每次都尽量现配现用。,主要仪器：,冷冻离心机、恒温培养箱、电热恒温水浴锅、数控超级恒温槽、精密pH计、分光光度计
3、、超声波细胞粉碎机,实验方法：,菌株的分离，初筛磷酸酶产生菌复筛磷酸酶产生菌产酶菌株碱性磷酸酶活力测定菌株的产酶时间不同pH缓冲溶液对酶活的影响酶的热稳定性试验,菌种的分离与产酶菌株的初筛,从湖边、花坛和竹林中3处取土样适量，加入10mL无菌水，25摇床振荡30min，取上清液作系列稀释，分别取0.2mL涂布LB培养基上，置于30培养24h，将长出的菌落分别命名。磷酸苯二钠比色法初测碱性磷酸酶活性。将0.lmol/L碳酸盐缓冲液(含4-氨基安替比林,pH10.0)50ul点样于40孔微孔板中(对照孔加量为55ul), 取各菌种等量菌苔与缓冲液充分混匀,于37水浴5min。再加入磷酸苯二钠溶液(
4、0.02mol/L)50ul,37反应15min。加入铁氰化钾溶液150ul,显色并终止反应。重复二次。以红色深浅初筛磷酸酶产生菌。,产酶菌株的复筛,将AP强阳性菌株接于20mL基础培养基中30培养20h，将培养好的菌液以10%接种量接入80mL发酵培养基中培养，16h后离心，收集上清用于测胞外酶活。沉淀用5mL0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液制成细胞悬液，超声破碎，离心后上清用于测胞内酶活。计算单位体积发酵液胞内和胞外AP酶活。,产酶菌株碱性磷酸酶活力测定,采用AP活性检测试剂盒。具体操作为将1mL反应液R1加到比色皿中，37孵育3min后加入20L待测样品，搅匀并保温30s，再加入
5、250L反应液R2到比色皿中，搅匀并保温30s，然后用分光光度计测定波长405nm处2min内的吸光度值变化。酶活性计算：碱性磷酸酶 AP（U/L）：A/minVt1000/ （eVsd）=A/minF式中：A/min：每分钟吸光度值变化率；Vt：反应液总体积，mL；1000：变化系数；e：6.22（摩尔吸光系数）；Vs：标本体积，mL；d：比色皿直径，cm。酶活定义：37条件下每分钟产生1mol游离酚的酶量为一个酶活单位（U）。,产酶菌株碱性磷酸酶活力测定,取目的菌种接于10mlLB培养液中摇床培养过夜,取菌悬液1ml接种于20mlLB培养液中,30,150r/min摇床培养,于24h,48
6、h分别各取5ml发酵液高速冷冻离心,6、5000rpm、10min。收集上清液(细胞外酶),备用。细胞沉淀用生理盐水洗涤一次,离心6、5000rpm、10min。弃上清,取细胞加5ml0.lmol/L碳酸盐缓冲液制成细胞悬液,冰水浴超声波粉碎细胞(120w,处理3s间隔6s,处理100次)。离心6 5000rpm、10min收集上清液(细胞内酶),备用。磷酸苯二钠比色法测试碱性磷酸酶活性:分别取细胞外和细胞内上清酶液0.smL加入到1.OmL含有0.15%4一氨基安替比林的碳酸盐缓冲液(0.1M,pH10),37 水浴smin,再加入0.02M磷酸苯二钠1.0ml37 水浴15min后立即加入
7、3ml铁氰化钾溶液显色立即充分混匀,用分光光度计于510nm波长处比色,用蒸馏水调零。以未接种的培养液为对照。酶活定义为:37下每分钟产生1umol游离酚的酶量为一个酶活单位助。,菌株的产酶时间,接菌株于基础培养液,每隔一定时间取样测酶活,并同时测细胞生长量。由于发酵液非匀质,故取5ml发酵液高速冷冻离心(条件同上),并以生理盐水洗涤一次,加生理盐水5ml制成细胞悬液,以生理盐水为对照于600nm测OD值作为细胞生长量。,不同pH缓冲溶液对酶活的影响,为确定最佳的缓冲液州,选择在不同pH(7、8、9、10、11)值的缓冲溶液中用磷酸苯二钠比色法测试碱性磷酸酶活性。,酶的热稳定性试验,用不同的温度(20 、30 、35 、40 、45 、50 )预处理上清液30min,然后用磷酸苯二钠比色法于37测试碱性磷酸酶活性。,谢谢,
