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1、1胃癌患者外周血 Survivin 基因 mRNA 表达及其临床意义【摘要 】 目的 检测胃癌患者外周血中肿瘤细胞 Survivin 基因mRNA 表达，探讨其在胃癌微转移检测中的意义。方法 采用逆转录分子信标实时荧光定量 PCR（RT-QPCR）方法，以 Survivin 基因 cDNA 克隆重组质粒为标准品，检测胃癌患者外周血肿瘤细胞中Survivin 基因 mRNA 模板拷贝数，分析拷贝数与临床资料之间的关系。结果 Survivin 基因 mRNA 分子信标实时定量方法的线性检测范围为 104109 个拷贝，外周血肿瘤细胞 Survivin 基因模板拷贝数与患者的性别、年龄、TNM 分期
2、及病理类型差异无显著性（P 0.05） ，而与患者淋巴结转移及生存状况差异有显著性（P0.05） 。结论 外周血肿瘤细胞 Survivin 基因 mRNA 表达可用于检测胃癌的血性转移，为早期诊断微转移的存在、评价患者预后、指导临床治疗提供依据。【关键词】 定量 PCR； survivin； 微转移； 外周血； 胃癌2Expression of survivin mRNA in peripheral blood of patients with gastric cancer and its clinical implication【Abstract】 Objective To study th
3、e mRNA expression of survivin gene in peripheral blood of patients with gastric cancer and its clinical significance.Methods The expression of survivin gene was detected by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction(RT-QPCR) using a molecular beacon probe， while recombination plasm
4、id containing the sequence of survivin was standard. It was analyzed that the relationship between copies of survivin expression in peripheral blood with gastric cancer and clinical data.Results A linear standard curve was obtained between 104 and 109 copies. The copies of survivin mRNA did not corr
5、elate with gender， age， TNM stage and histological types (P0.05). There were the relationships between copies of survivin gene with lymph node metastasis and poor survival (P0.05).Conclusion The expression of survivin mRNA can be used to detecte micro-metastasis in peripheral blood circulation of ga
6、stric cancer. It is a useful marker to predict prognosis and decide on clicinal therapy.3【Key words】 quantitative PCR； survivin； micrometastasis； peripheral blood； gastric carcinoma胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，在临床治疗中，复发和转移是常见的问题，直接影响到患者的预后。早期发现肿瘤患者外周血中是否有肿瘤细胞存在，不仅对判断肿瘤转移和复发有着重要的价值，而且对指导临床治疗，改善患者预后有重要的意义。随着逆转录多聚酶链
7、反应（RT-PCR ）技术的广泛应用，可以检测到肿瘤患者外周血中常规方法（如 CT、MRI 、普通形态学及免疫组织化学等）无法检测到的极少数肿瘤细胞中特异基因 mRNA 的表达，预示肿瘤的微小转移存在。近来，特别是荧光实时定量 PCR 技术的发展，不仅可以定量检测 mRNA 的原始模板拷贝数，而且由于特异性探针的引入，使其灵敏度也高于常规 PCR 的定性检测。Survivin 是 1997 年1 发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis， IAP）家族成员之一，它在终末分化的成人正常细胞中很少表达，而在绝大多数肿瘤细胞中高表达2，3 。文献报道46 ，胃癌患者中 Sur
8、vivin 基因 mRNA 表达阳性率高达 60%以上，使其很有可能成为一个潜在的胃癌肿瘤标志物。本文采用逆转录分子信标实时荧光定量 PCR（RT-QPCR）技术，选择 Survivin 基因作为胃癌微转移的研究靶点，定量检测胃癌患者外周血中Survivin 基因 mRNA 的模板拷贝数，探讨其在胃癌微转移中的意4义。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本收集 本院 2001 年 11 月 2003 年 11 月手术切除经病理证实的胃癌患者 56 例，其中男 34 例，女 22 例；年龄 3886岁，中位年龄 56 岁； TNM 分期：期 3 例，期 19 例，期21 例，期 13 例；组
9、织学类型：低分化腺癌 16 例，乳头状/管状腺癌 11 例，黏液癌 14 例，混合性癌 15 例；按生存期分组：30 个月内无转移复发者 30 例，为生存组；30 个月有转移复发或死亡者26 例，为转移死亡组。1.1.2 探针及引物 上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游引物：5-CCT GGC AGC CCT TTC TCA-3，下游引物：5-TCA GTG GGG CAG TGG ATG-3，分子信标探针：5- CCG CAT CTC TAC ATT CAA GAA CTG GCA TGC GG -3 （画线部分为探针自身互补序列） ，探针的 5端标记荧光基团 FAM，3端标记淬灭基团
10、 DABCYL；扩增片段大小 121bp。1.2 方法51.2.1 总 RNA 提取 术前取患者静脉血 5ml，枸橼酸钠抗凝，淋巴细胞分离液（灏洋公司产品）分离有核细胞，生理盐水洗涤 3 次，于-80冰箱保存。采用 Trizol（Invitrogen 公司产品）试剂提取细胞总 RNA，分光光度法测定 RNA 的浓度和纯度， 1%琼脂糖电泳鉴定 RNA 的完整性。1.2.2 cDNA 的合成 以 2g总 RNA 为逆转录模板，以Oligo(dT)12 为引物，在 M-MLV 逆转录酶作用下合成单链cDNA。 1.2.3 实时荧光定量检测 以 Survivin 基因 cDNA 克隆重组质粒7为定量
11、检测标准品，在 20 l反应体系中加入 10l Universal PCR Master Mix (ABI 公司产品) ，上、下游引物及分子信标探针各200nM，不同模板拷贝数的标准品或 100ng 待测样本 cDNA。在ABI 7500 荧光定量 PCR 仪进行定量检测，反应条件为 50 温育2min；95预变性 2min； 95 20s， 6060s，45 个循环。每个标准或样本重复检测 2 次。1.2.4 统计学处理 数据分析使用 SPSS11.0 软件包进行。Survivin mRNA 模板拷贝数转换为对数进行统计分析，模板拷贝数与病理类型间的比较采用方差分析，与其他临床参数之间的比较
12、采6用独立样本 t 检验。2 结果2.1 RNA 鉴定 提取的外周血有核细胞总 RNA，以 OD260/280的比值鉴定 RNA 的纯度，比值在 1.82.0 之间，大于 1.8，说明提取的 RNA 无蛋白的污染。以琼脂糖电泳鉴定 RNA 的完整性，可见明显 18S 和 28S 的 RNA 区带，二者比例约为 1：2（见图 1） ，说明提取的 RNA 无明显降解。2.2 实时定量检测 标准品检测范围 104109 个拷贝（见图 2） ；以每个标准拷贝数的对数为横坐标，以荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数（Ct 值）为纵坐标，绘制标准曲线，得到一条直线，其直线截距 a=65.3664，斜率 b
13、=-5.3151，相关系数 r =0.9940；根据被检测样品的 Ct 值，通过标准曲线计算出样本的模板拷贝数。图 1 胃癌患者外周血有核细胞1%琼脂糖 RNA 电泳7图 2 Survivin 分子信标荧光定量 PCR 检测标准曲线2.3 Survivin 模板拷贝数与临床资料的关系 本研究对未检测到Survivin mRNA 表达的样本，模板拷贝数以“0”计入统计资料。56 例胃癌患者外周血肿瘤细胞中 Survivin 基因 mRNA 模板拷贝数均值为 2727.63 个拷贝，标准差为 341.94 个拷贝；拷贝数与临床资料之间的关系见表 1，结果显示：外周血中 Survivin 基因mRN
14、A 拷贝数与患者的性别、年龄、TNM 分期以及病理类型差异无显著性（P0.05） ，而与淋巴结转移和患者生存期差异有显著性（P0.05） 。表 1 胃癌患者外周血 Survivin mRNA 拷贝数与临床资料的关系3 讨论肿瘤的浸润和转移是影响患者预后的重要因素，其中肿瘤细胞在血液循环中播散是肿瘤转移的方式之一，属于肿瘤转移的早期阶段，称为微转移。检测患者外周血中微转移的存在，及时进行干预性治疗，可有助于减少肿瘤的复发和转移，提高患者生存率，降低死亡8率。在微转移的检测中，检测方法的灵敏度和靶基因的选择就显得尤为重要。检测灵敏度越高，微转移发现的越早，对患者的治疗越及时；靶基因首先应该选择肿瘤
15、细胞特异性的，其检测的结果能够正确反映肿瘤细胞的存在。常规 PCR 方法仅是对扩增后的产物进行定性或半定量检测，而非检测原始模板量。目前新的技术实时荧光定量 PCR 技术，是在进行特异性引物扩增时加入特异的荧光探针进行杂交，在 PCR 扩增的同时即可通过探针荧光信号的变化观察结果，不仅简化了检测手段，而且大大地提高了检测方法的灵敏度。在有标准品存在时，还可对原始模板进行拷贝数定量。对于 Survivin 基因 mRNA 表达的检测，实时荧光定量检测方法的灵敏度要高于普通 PCR 方法至少一个数量级以上8 。人类 Survivin 基因定位于染色体 17q25，全长 14.7kb，包含 3个内含
16、子和 4 个外显子， mRNA 长度 1.9kb，表达一个相对分子量为 16.5KD 的蛋白。Survivin 是 IAP 家族的重要成员，它是以细胞周期依赖方式，特异地表达于 G2/M 期，与有丝分裂纺锤体结合，对促进细胞增值有着非常重要的作用9 。 Survivin 是迄今发现的最强的凋亡抑制蛋白，其抗凋亡作用远大于 bcl-2 家族，且与肿瘤的发生发展密切相关10，11 。因其具有仅在肿瘤细胞中表达的特性，Survivin 有可能是恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点，成为判断9患者预后的重要参考指标12 。由于外周血循环系统中存在 RNA 酶，因此，进入循环系统中的游离 mRNA 分子迅速被降解而不能被检测到，所有在外周血中检测到的 mRNA 表达一定是存在于细胞内的 mRNA 分子。如果所检测的基因仅在肿瘤细胞中特异表达，即说明血循环中有肿瘤细胞存在，预示着可能出现肿瘤的复发和转移。Survivin
