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1、1胃癌中 p16 基因研究概况分子生物学和基因工程技术的迅速发展使我们认识到，胃癌的发生同其他肿瘤一样是正常细胞内基因组多重改变的结果。自发的、化学物理性及病毒性致癌因素只是诱因，基因改变才是根本原因，它包括癌基因的激活和抑癌基因的失活1 。p16(MTS1、CDKN2、CDK4I)基因是新近发现的抑癌基因，与p53 基因相比，它具有突变率高、分子量小、易于标定等特点，因而很快成为肿瘤分子生物学研究的热点。本文就胃癌中 p16 基因的研究情况作一概述。 1p16 基因的分子生物学特点 1993 年，Serrano 等2在研究与细胞周期素依赖性激酶4(cyclin dependent kinas
2、e 4, CDK4)相作用的蛋白时，用酵母双杂合蛋白相关性筛选(yeast two-hygrid protein interaction screen)法分离到了特异性 CDK4 抑制蛋白 p16 蛋白，并成功地克隆了其 cDNA。1994 年 Kamb 等3 用 STS-PCR(serveral-tagged sites-PCR，多标志位点 PCR)方法研究了 100 个黑色素瘤2细胞系，发现了在人第 9 号染色体短臂(9p21)区域存在有与Serrano 等报道的 p16 序列相近的 2 个区域，分别命名为多发性肿瘤抑制因子 1(multiple tumor suppressor 1, M
3、TS 1)和多发性肿瘤抑制因子 2(MTS 2)，其中 MTS 1 与曾报道的 p16 基因完全吻合，而 MTS2 与 p16 基因有 93%的序列同源，目前已命名为 p15 基因。与此同时，Nobori 等4的研究也证实了上述结论。Serrano 等2指出，p16 基因定位于人第 9 号染色体的 9p21 区位，分布在全长为 8.5 kb 的 DNA 区段内，由 3 个外显子和其间的 2 个内含子组成，3 个外显子的长度分别是 126 bp、307 bp、11 bp。编码蛋白为 15.845 kD、含有一个由 148 个氨基酸残基组成的开放阅读框架的单链多肽，具有 4 个沟回状重叠的空间构型
4、，该结构特别是第4 个重叠是保持 p16 基因的活性所必需的。 2p16 基因在胃癌中的表达及意义 国内外学者的研究结果表明，p16 基因与胃癌分化、浸润、淋巴结转移及患者预后有显著的相关性，检测胃癌组织 p16 基因的各种变化，有助于对胃癌生物学行为的进一步了解和对患者预后的评估。 3p16 基因在胃癌中可发生纯合性缺失、5端 CpG 岛异常甲基化、表达下降等 3 种形式的改变。纯合性缺失是指两个等位基因完全丢失，表现为 PCR 扩增无产物或 Southern 杂交信号完全消失。事实上，在已普查过的近 300 个癌细胞株中，p16 基因最易发生纯合性缺失，可能的原因是另有抑癌基因在 9p21
5、 上与之连锁，如p15 基因。CpG 岛是 DNA 的一段区域，长度约 0.52.0 kb，富含 GC，在正常组织中没有甲基化5 。p16 基因常因转录启动区域 5-CpG 岛异常甲基化而被灭活 5，6 ，表现为等位基因不转录或异常转录，应用逆转录嵌套式聚合酶链反应(RT-NPCR)法可测得异常转录物。 p16 基因发现后不久，日本学者 Igaki 等7就对 9 例胃癌细胞株进行了 Southern 杂交分析，发现 4 例低分化胃癌细胞株中有 2 例(22%)发生纯合性缺失，而高分化组未见缺失。Akama 等8用同法检查了 8 例胃癌细胞株，结果发现 2 例(25%)存在 p16基因的纯合缺失
6、，另有 2 例虽未测得基因改变，但均未表达 p16，考虑存在 5-CpG 岛异常甲基化。吕有勇等9检测 5 株胃癌细胞系，有 1 株(20%)存在 p16 基因纯合缺失，另有 2 例未见明显的基因丢失，但没有表达或表达下调；在 85 例胃癌组织中，14 例(16.4%)存在 p16 基因纯合缺失，这些缺失的病例都属于低分化、4有淋巴结转移的进展期胃癌，提示 p16 基因结构和表达异常与胃癌分化、转移相关。前不久，Chen 等10运用 RT-NPCR 方法检测了 10 例肠型胃癌、11 例弥漫型胃癌，结果分别发现 3 例(30%)和 5 例(45.5%)中存在异常 p16 mRNA 转录物，其中
7、大多数有外显子 1 和外显子 2 的核苷酸序列的部分缺失，认为 RT-NPCR 法是检测小的基因内缺失的有效方法，异常 p16 ;mRNA 转录物在胃癌中属频发事件。另外，国内学者进行的大量胃癌中 p16 蛋白表达的研究充分显示，p16 蛋白在胃癌组织中表达明显降低，且与胃癌分化、浸润、淋巴结转移、患者预后明显相关11，12 。 3p16 基因的生物学作用 研究表明，细胞癌变与细胞周期失控密切相关，典型的一个细胞周期包括有顺序严格的 4 个期即 G1SG2M。细胞周期进行的关键在于 CDKs 的活化，而 CDKs 受细胞周期素(cyclin)及其抑制蛋白的正负调节。已发现的 8 种 cycli
8、n 中，尤以 cyclin d 家族对细胞增殖具有最重要的意义，实验表明，阻滞 cyclin D 的表达使细胞不能从 G1 期S 期，而其过表达则使 G1 期缩短13 。cyclin d 包括 D1、 D2、D3 三个亚型，分别在不同的细胞系中表达。cyclin d1 与 CDK4/6 结合形成复合物，能使视网膜母细胞瘤易感基5因(即 Rb 基因，为一种抑癌基因)的蛋白产物 PRb 磷酸化，进而激活某些转录活化因子如 E2F(异源双体转录子)，E2F 则能活化 DNA合成基因和细胞生长控制基因，启动 DNA 合成，使细胞由 G1 期进入 S 期14 。而 p16 蛋白则为 CDK4/6 抑制剂
9、，对 CDK4/6 有高度亲和性，在细胞增殖的调控中，p16 蛋白与 cyclin d1 竞争与CDK4/6 结合，发挥负性调节作用，共同完成对细胞增殖周期的调控15 。因此，当 p16 基因发生改变，在肿瘤组织中表达异常时，则有可能导致肿瘤发生、进展。 4p16 基因与癌基因 cyclin D1 及抑癌基因 Rb 的关系 cyclin D1 对细胞增殖具有重要意义，其过度表达会导致细胞增殖失控，因而被认为是一种癌基因16 。实验上，胃肠癌、乳癌、食管癌以及 B 细胞淋巴瘤中都有 cyclin d1 的过表达17 。Rb 基因则是经典的，也是最早发现的抑癌基因，cyclin d1、Rb 基因对
10、 p16 基因的调控具有重要的意义。 Shapiro 等18应用免疫组化和免疫印迹分析技术分别对PRb 阳性占多数的非小细胞肺癌(NSCLC)和 PRb 阴性的小细胞肺癌(SCLC)的手术标本及细胞系进行了测定，结果显示 PRb(+)的6NSCLC 几乎没有 p16 表达，而 PRb(-)的 SCLC 则有高丰度的 p16表达。Tam 等19在体外转化细胞中的研究也得到相类似的结果，发现 p16 表达与 Rb 表达呈负相关。推测其可能机理是 CDK 在某些情况下被激活，如当 p53 失活或表达下调引起 p21 随之下调，激活了 CDK，使 Rb 蛋白磷酸化而失活， Rb 蛋白的抑制作用减弱，从
11、而使 p16 蛋白表达代偿性增加，导致 cyclin d1 活性下降。p16 的激活与 cyclin D1 的下调反过来抑制 CDK 的活性。因此，cyclin d1、Rb 、p16 和 CDK 共同组成了一个反馈调节圈。对细胞周期的研究发现，在生理情况下，在 G1S 期的转化早期，cyclin d1 水平增高，随 G1S 期的转化，活化的 cyclin D1/CDK4 复合物渐趋失活，而此时 p16 表达达到高峰( 失活的 PRb 通过转录因子 E2F 促进 p16 转录)，p16 反过来又抑制 cyclin d1 对 CDK4/6 的活化作用，当 Rb 基因突变或缺失或 cyclin d1
12、 的过表达超出了 p16 基因的代偿能力时，细胞周期调节失控，细胞过度增殖导致癌变3 。 综上所述，由于 p16 基因与胃癌发生、进展有密切关联，其作用机理为直接抑制细胞周期，且 p16 基因分子量小，易于标定，用 p16 基因作靶分子进行基因操作或蛋白修饰，均比 p53 简单易行。因此，已有学者将外源性 p16 基因导入有 p16 基因表达异常的人胃癌细胞株中。结果显示，导入外源性 p16 基因对胃癌细胞系PAMC82 的裸鼠致瘤性有十分明显的抑制作用20 。另外，由于7p16 基因与 Rb、cyclin d1 等共同参与了细胞增殖周期的调节，因此，对 p16 基因的深入研究，对于阐明细胞周
13、期演进的分子调节，乃至整个生命活动过程的调节，均具有重要的意义。 参考文献 1Deng GR, Lu YY, Chen SM, et al. Actived c-H-ras oncogene with a guanine to thymine transversion at the twelfth codon in a human stomach cancer cell line. Cancer Res, 1987; 47(12)3159 2Serrano M, Hannon GJ, Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control c
14、ausing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature, 1993;366(16)704 3Kamb A, Gruis NA, Feldhaus JW, et al. A cell cycle 8regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994; 264436 4Nobori T, Miura K, Wu DJ, et al. Deletion of the cyclin-dependent kinase4 inhibitor gene in
15、multiple human cancers. Nature, 1994; 368(6472)753 5Herman JG, Merlo A, Mao LI, et al. Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrent DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res, 1995; 55(20)4525 6Merlo A, Herman JG, Mao L, et al. 5CpG island methylation i
16、s associated with transcriptional silencing of the tumor suppressor p16/CDKN2/MTS1 in human cancer. Nat Med, 1995; 1(7)686 7Igaki H, Sasaki H, Kishi T, et al. Highly ;frequent 9homozygous deletion of the p16 gene in esophageal cancer cell lines. Biochem Biophys Res Commun, 1994;203(2)1090 8Akama Y, Yasui W, Kuniyasu H, et al. Genetic status and expression of the cyclindependen
