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1、 生物工程学报 Chin J Biotech 2011, September 25; 27(9): 13901396 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 2011 CJB, All rights reserved. Received: November 23, 2010; Accepted: January 20, 2011 Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30972772). Corresponding author: Junjie
2、Xu. Tel: +86-10-66948491; E-mail: Wei Chen. E-mail: 国家自然科学基金 (No. 30972772) 资助。 生物技术与方法 稳定表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的RAW264.7细胞系的建立 李浩，殷瑛，董大勇，张军，付玲，蔡晨光，王猛，徐俊杰，陈薇 军事医学科学院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071 摘 要: 为研究结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis分泌蛋白ESAT-6 (Early secreted antigenic target of 6 kDa) 对巨噬细胞相关功
3、能的影响，将正确构建的重组质粒pEGFP-C1-ESAT-6和空载体pEGFP-C1以脂质体介导的方法转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7中，经过G418筛选后建立稳定表达EGFP-ESAT6融合蛋白以及EGFP的细胞系，并通过RT-PCR、荧光显微镜及Western blotting方法，在基因和蛋白两个水平对所建立的稳转细胞系进行鉴定。结果证实EGFP-ESAT6融合基因成功整合入RAW264.7细胞基因组并能够稳定表达，为后续的ESAT-6调控巨噬细胞机理研究提供了平台。 关键词: ESAT-6，RAW264.7，稳定转染，表达 Establishment of RAW264.7 cell
4、 line stably expressing Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6 Hao Li, Ying Yin, Dayong Dong, Jun Zhang, Ling Fu, Chenguang Cai, Meng Wang, Junjie Xu, and Wei Chen State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071, China Abstract: For stu
5、dying the effects of Mycobacterium tuberculosis secretory protein ESAT-6 on the related functions of macrophages, RAW264.7 cells were transfected with pEGFP-C1-ESAT-6 and pEGFP-C1 by liposome respectively. After screening with a high level of G418, the macrophage cell lines that stably expressed EGF
6、P-ESAT-6 fusion protein or EGFP were established. The gene and protein expression levels were further analyzed by RT-PCR, fluorescence microscopy and Western blotting. The results indicated that the EGFP-ESAT6 fusion gene was integrated into the chromosome and the protein could be stably expressed i
7、n the selected macrophage cell line. These results gave us a tool for the future study in the mechanisms of ESAT-6 protein in modulating the macrophage cells. Keywords: ESAT-6, RAW264.7, stable transfection, expression 李浩等: 稳定表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的RAW264.7细胞系的建立 1391 J 结核 (Tuberculosis，TB) 目前仍是威胁人类的三大感染性
8、疾病之一，每年约170万人病死。多重耐药结核分枝杆菌的大量出现以及艾滋病 (AIDS) 蔓延，导致全球结核病疫情呈现急剧的上升趋势1-2。结核菌如此猖獗的一个主要原因是其能够入侵和调控机体的防御系统。了解结核分枝菌如何改变机体的防御将有助于研发用于结核防治的更有效的疫苗和药物。 结核分枝杆菌的上清滤液中存在许多具有高度免疫原性的小分子蛋白。其中ESAT-6蛋白是这些蛋白分子的代表，ESAT-6蛋白具有Trp-Xaa-Gly (WXG) 氨基酸结构域，由95个氨基酸组成3。研究发现，ESAT-6与结核分枝杆菌的毒力相关，可通过多种方式调节巨噬细胞的功能。如Ganguly等4-5发现分泌蛋白ESA
9、T-6参与到调节巨噬细胞内有丝分裂原激活蛋白 (MAP) 激酶途径。ESAT-6能够下调依赖ERK 1/2的脂多糖 (LPS) 诱导基因c-myc的表达。同时ESAT-6能够通过下调氧化自由基 (ROS) 的水平来抑制依赖NF-kappaB基因的表达。另外有研究表明ESAT-6作用于巨噬细胞能够有效地激活caspase-1和促进IL-1因子的释放6。 尽管目前对ESAT-6调控巨噬细胞功能的研究已有一些数据，但其具体的调控机理仍需进一步探索。特别是已有结果主要是以结核杆菌野生型和突变株感染巨噬细胞而获得，对ESAT-6功能的分析很难排除其他细菌蛋白的影响。为进一步探讨ESAT-6蛋白本身对巨噬
10、细胞的作用，本研究构建了真核表达载体pEGFP-C1-ESAT-6，并将其转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7，经筛选获得稳定表达ESAT-6的稳转巨噬细胞系，为后续试验提供了研究平台。 1 材料与方法 1.1 材料 质粒pET21a(+)-ESAT-6为本实验室构建。Universal Genomic DNA Extraction kit ver.3.0以及Probest DNA 聚合酶购自TaKaRa公司。限制性核酸内切酶Xho、BamH以及T4 DNA连接酶均购自New England Biolabs公司。Endo-free plasmid mini kit 质粒提取试剂盒购自OMEGA公
11、司。感受态大肠杆菌DH5细胞、Quantscript RT kit Quant cDNA第一链合成试剂盒以及RNA simple Total RNA kit购自Tiangen公司。真核细胞转染试剂Lipofectamine LTX and PLUS Reagents购自Invitrogen公司。Anti-ESAT-6 antibody购自abcam公司，Anti-GFP antibody 购自ebioscience公司，HRP标记的Goat anti-Mouse IgG购自Santa Cruze公司。DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司，GFP标签蛋白裂解液 (分子量：35 kDa) 购
12、自北京康为世纪公司，RIPA裂解缓冲液购自普利莱公司。小鼠巨噬细胞RAW264.7和pEGFP-C1载体为本实验保存。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。其他试剂均为国产和进口分析纯。 1.2 方法 1.2.1 ESAT-6基因的扩增 以pET21a(+)-ESAT-6为模板，使用引物 (F1，R1) 利用PCR方法扩增出ESAT-6基因 (引物见表1)。PCR条件为：94 5 min；94 30 s，70 30 s，72 30 s，30个循环；72 7 min。 1.2.2 质粒的构建和鉴定 通过Xho和BamH限制酶切位点将PCR产物双酶切后连入表达载体pEGFP-C1，将连接产物转化入
13、大肠杆菌DH5进行扩增，随机挑选菌落进行菌落PCR鉴定，并进行酶切鉴定，送上海英骏生物技术有限公司测序。测序正确的质粒命名为pEGFP-C1- ESAT-6。 1.2.3 细胞转染和筛选 转染前1 d接种RAW264.7细胞于24孔板(每孔约2.0105个)，待细胞汇合度达到6080时用于转染。转染当天，先给细胞换液，向每孔加入0.5 mL完全培养基 (不加抗生素)。转染时分为脂质体对照组、pEGFP-C1组和pEGFP-C1-ESAT-6组，每1392 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech September 25, 2011 Vol.27 No.
14、9 J 组设置2个复孔。pEGFP-C1和pEGFP-C1-ESAT-6质粒均转染1.2 g，PLUS和LTX的用量均分别为1 L和3 L。转染24 h后加入G418至终浓度为800 g/mL，每2天更换培养液，同时以未转染的RAW264.7细胞作为阴性对照。培养14 d后，转染细胞有抗G418的克隆长出，而阴性对照细胞全部死亡。将转染细胞有限稀释并克隆化培养于96孔培养板中。培养6 d后，挑选单克隆细胞生长孔于倒置荧光显微镜下观察，有绿色荧光的细胞为阳性细胞。将挑选的阳性单克隆传代同时命名为RAW-EGFP和RAW-E6。 1.2.4 ESAT-6基因整合的PCR检测 分别收集RAW-EGF
15、P和RAW-E6细胞。按Universal Genomic DNA Extraction kit ver.3.0.试剂盒操作说明提取全基因组，根据pEGFP-C1的特征在Xho和BamH酶切位点附近设计2条引物 (F2，R2)。若pEGFP-C1-ESAT-6整合入细胞染色体，则扩增出EGFP-ESAT6的全长约为1 173 bp，相反只能扩增出EGFP的长度约888 bp。 1.2.5 ESAT-6基因的转录水平的RT-PCR检测 收集RAW-EGFP和RAW-E6细胞。按RNA全基因组提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，在0.25 mL的Eppendorf管进行反转录，获得cDNA第一链。反转录反应体系为20 L，其中随机引物 (10 mol/L) 2 L，dNTPs (DEPC 水溶解) 2 L，RNase-free水12 L，Quant 反转录酶 1 L，模板RNA 1 L。反应条件为：37 ，60 min。80 保存。取5 L cDNA用于PCR扩增ESAT-6，-actin基因作为内参，扩增引物为(F3，R3)。 1.2.6 荧光显微镜观察 使用6孔板培养转入RAW-EG
