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1、1肾肿瘤中浸润性树突状细胞的免疫状态变化作者：闫东，王勤章，张国玺，倪 钊，李应龙，王新敏，谢顺明，王江平，杨安强，丁国富【摘要 】 目的 通过分析肾肿瘤中浸润性树突状细胞的免疫状态变化，以探讨其在肾肿瘤微环境中的功能状态。方法 选择未经任何非手术治疗的肾透明细胞癌患者标本 40 例作为实验组， 10 例正常肾组织作为对照组，通过免疫组织化学技术标记组织中树突状细胞(dendritic cell, DC)的 CD1a、HLA-DR 和 CD86 抗原，观察正常肾及肾透明细胞癌组织中 DC 的 3 种抗原的表达，结果进行统计学分析。结果 所有肾透明细胞癌组织中均未见明显 CD86+ DC，但均有
2、 CD1a+ DC，其在肾癌组织中的浸润程度明显高于正常肾组织(P0.05)。结论 DC 具有趋化性，可以向肿瘤组织聚集，肾癌组织中存在 CD1a，肾癌患者 CD86 表达低下，提示肾癌患者 DC存在免疫缺陷，而 DC 的免疫功能低下则可能是肾癌逃避宿主免疫监视的主要原因。 2【关键词】 树突状细胞；肾肿瘤；免疫状态树突状细胞(dendritic cell, DC)是目前已知功能最强的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)，能诱导针对肿瘤相关抗原的特异性 T 淋巴细胞反应，DC 最大的特点是能够显著刺激初始型 T细胞(naive T cells)增殖，其抗原提
3、呈能力是其他抗原提呈细胞的10-100 倍1 。诸多的研究证实， DC 能在体外摄取肿瘤抗原，并在体内激活初始 T 淋巴细胞产生抗原特异性，从而在肿瘤免疫中发挥重要的作用。然而，肿瘤宿主本身 DC 并没有激发机体免疫系统产生有效的抗肿瘤效应，说明肿瘤微环境中的 DC，即肿瘤浸润性DC(tumor infiltrating dendritic cell, TIDC)可能存在免疫缺陷，从而导致肿瘤的免疫逃逸。因此研究 TIDC 有助于揭示肿瘤免疫逃逸的机制。本文采用免疫组化技术，对 40 例肾癌患者 TIDC 的免疫状态进行分析，以探讨肾癌中 TIDC 与肿瘤免疫的关系。1 材料与方法1.1 材料
4、1.1.1 标本收集 在新疆石河子大学第一附属医院 1990-2006 年收治的肾肿瘤患者中，筛选出初发并且未经任何非手术治疗患者的3手术切除标本 40 例，男性 26 例，女性 14 例，年龄 38-73 岁，平均 55 岁。术后病理证实为肾透明细胞癌作为实验组。组织学分级以往最常用的是 1982 年 Fuhrman 四级分类2-3 。1997 年WHO 推荐将 Fuhrman 分级中的、级合并为 1 级即高分化、级为中分化、级为低分化或未分化。故采用将肾癌分为高分化、中分化、低分化(未分化) 的分级标准4 。分期采用 2002 年 AJCC的 TNM 分期和临床分期2 。40 例肾透明细胞
5、癌中高分化 28 例，中分化 9 例，低分化(未分化)3 例；临床期 29 例，期 9 例，-期 2 例。另外,收集该院的正常肾组织标本 10 例作为对照组。1.1.2 主要试剂和设备 鼠抗人 CD1a(购自中国福州迈新公司) ，鼠抗人 CD86(购自 R&DSystems 公司，英国 )，鼠抗人 HLA-DR(购自上海基因公司)。免疫组化成套试剂盒(购自中国福州迈新公司)。1.2 方法1.2.1 标本处理及切片制作 所有标本均经 10%(体积分数) 中性甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋，取 4 m 厚的连续切片，置于 65 烘箱内烘烤 6 h 以上备用。1.2.2 免疫组化染色(S-P 法) 按
6、有关试剂的产品说明书进行操作。4常规脱蜡至水，滴加过氧化物酶阻断剂 10 min 后行抗原修复。依次滴加一抗，生物素标记的二抗。每步骤后均用缓冲液(PBS)洗涤 5 min，DAB 显色，苏木素复染，干燥，中性树胶封片。抗原修复方法：针对 CD1a、HLA-DR 及 CD86 采用不同的抗原修复方法。CD1a 于二氨四乙酸二钠(ethylenediaminete-traacetic，EDTA)(pH 8.0)修复液，HLA-DR、CD86 于枸橼酸缓冲液(pH 6.0)修复液中，微波炉强火 3 min 左右至煮沸，微波炉低火 5 min，连续 3 次。实验对照：以 PBS 代替一抗作为阴性对照
7、,以正常肾组织作为阳性对照。1.2.3 计数方法 由 3 位病理科主治医师阅片。每张切片任意取DC 分布最密集的 5 个区，在高倍视野下(HPF400)计数 CD1a 阳性细胞的数目。以 5 个高视倍视野下 CD1a 阳性细胞平均数代表该标本切片中的 DC 浸润程度。采用成组资料样本均数的 t 检验统计分析实验组与对照组的 CD1a+ DC 浸润程度。HLA-DR 以细胞膜或胞浆染成黄色、棕色或棕褐色且其染色强度高于背景非特异染色者为阳性细胞；同一阳性片中，不同区域染色强弱不尽相同。按许良中5等级评分方法，根据阳性染色强度和阳性细胞所占百分比对HLA-DR 表达进行评估。按染色强度评分：无色
8、0 分，淡黄色 1 分，棕黄色 2 分，棕褐色 3 分；按染色阳性细胞所占百分比评分：阴性0 分，阳性细胞75% 4 分。阳性率的确定由经验丰富的病理医生协助进行，两5者相乘分值3 为阳性，分 4 等级：-(2 分)、+(3-4 分) 、(5-8 分)、(9-12 分 )。1.2.4 统计方法 采用 SPSS11.5 统计软件进行统计学处理。实验结果以均数标准差表示，原始数据作方差齐性检验后作 t 检验；多组间比较采用 One-Way ANONA 分析。2 结 果2.1 抗原表达状况 CD1a 在癌组织中有强阳性表达，表达部位为DC 的胞浆和胞膜(图 1)。CD86 在肾细胞癌未见确切表达，在
9、正常肾组织中主要分布在肾小管细胞(图 2)。HLA-DR 表达特异性较差，阳性细胞为细胞质内和(或) 细胞膜呈棕黄色颗粒着色( 图 3)。2.2 DC 浸润程度2.2.1 CD1a+ DC 的浸润程度 CD1a 阳性 DC 在肾癌组的浸润数目高于正常肾组织组，其差异有显著性(P0.05，表 4)。表 4 肾癌组织与正常肾组织中 DC 的 HLA-DR 阳性表达率的比较3 讨 论DC 是目前已知功能最强的抗原提呈细胞。在体内，它经历不成熟到成熟的发育过程。随着发育成熟，DC 能表达一系列分化抗原，其中与功能直接有关的是 CD1a、MHC-I 类分子、HLA-DR、CD80 、CD83 、CD86
10、 等。本研究通过免疫组织化学染色观察发现，DC 胞体形状不规则，向外伸出长短不等的突起，这一形态特征与 DC 的功能有密切关系，这使其能有效地摄取抗原并选择性地作用于体内数量极少的抗原特异性淋巴细胞，从而发挥抗原提呈的作用。在 DC 的一系列分化抗原中 CD1a 是一种递呈脂类抗原的分子，目前被公认为 DC 的主要特征性标志，已广泛地应用于 DC 分离、纯化和体外培养的鉴定。笔者采用 CD1a 免疫组化技术标记 DC，结果表明肾癌中 CD1a+DC 的浸润程度明显高于正常肾组织。表明DC 具有趋化性，可以向肿瘤组织聚集。同时研究发现 CD1a+DC7的浸润与肾癌临床病理分期及组织学分级均无明显
11、的统计学意义，提示肿瘤组织中的未成熟 DC 数量不能作为肿瘤预后的指标。CD86在肾细胞癌中未见确切表达，正常肾组织主要表达于肾小管细胞，表明和其他器官的肿瘤一样，肾细胞癌中 CD86 的表达明显下降。近年的研究证明，CD86 表达于 APC 主要是 DC 表面，与表达在 T细胞上的配体 CD28、CD152 结合后，提供协同刺激信号，导致 T细胞的活化6 。由于肿瘤细胞的共刺激分子的低水平表达,不能使肿瘤抗原引起有效免疫应答，从而诱导了 T 细胞的无能状态,使得机体的免疫系统不能将肿瘤细胞清除,是肿瘤无限制性生长的主要原因之一7-8 。因此，可以认为肾细胞癌表达共刺激分子 CD86 的水平下
12、降可能与肿瘤细胞“逃避”机体的免疫监视有关。HLA-DR 是MHC-类分子,能与经胞内处理的抗原多肽结合而高表达于成熟DC 的表面,以利于 DC 的抗原提呈。HLA-DR 的不表达或低表达说明 DC 提呈外源性抗原能力低下。本研究结果显示，在 40 例肾癌实质内有 34 例存在 HLA-DR+DC，其阳性表达率为 85%，较正常肾组织内 DC 的 HLA-DR 表达率略高，但差异无显著性。说明肾癌中浸润的 DC 经历肿瘤抗原刺激，产生一定程度的 HLA-DR 表达，且HLA-DR 表达程度高于 CD1a 和 CD86，这可能由于该抗原在 DC中存在时间较长，而 CD86 和 CD1a 分子仅存
13、在于 DC 成熟过程中的某一特定阶段，存在时间较短，随 DC 功能状态的改变而表达缺失。至于 TIDC 功能成熟缺陷以及浸润程度下降的可能机制，有实验研究证明：癌细胞可诱发 DC 的凋亡，从而导致 DC 在肿瘤微8环境中的数量下降9 ；肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子 ,可于造血前体细胞水平抑制 DC 而导致荷瘤宿主 DC 的数量减少10 ；肿瘤分泌的其他一些因子，如 IL-10 可以抑制 DC 的分化成熟，下调共刺激分子的表达，并可抑制 DC 在肿瘤内的聚集11 ，TGF- 可显著抑制 DC 的产生和 DC 的分化成熟12 。综上所述，TIDC 的异常破坏了机体的局部免疫监视系统与肾癌的发生有
14、密切关系，由于成熟的 TIDC 数量少及 TIDC 功能缺陷使得肿瘤抗原无法被有效提呈，加之 DC 表面共刺激分子和黏附分子的低表达或不表达，不能提供激活 T 细胞所需的共刺激信号，影响DC 的抗原提呈能力，因而无法诱导肿瘤特异性杀伤性 T 细胞反应，最终导致肾肿瘤的免疫逃逸。提示临床上可以通过使用 DC 疫苗或者其他手段增加肿瘤内成熟 DC 数量与活性，通过产生更多的表面刺激因子，从而有效地提呈肿瘤抗原，提高机体对肿瘤的免疫杀伤力。【参考文献】 1Inaba K, Pack M, Inaba M, et al. High levels of a major histocompatibilit
15、y complex -self peptide complex on dendritic from the T cell areas of lymph node J. J Exp Med, 1997, 186(5):665-672.92顾方六. 肾肿瘤 M/吴阶平. 吴阶平泌尿外科学.济南：山东科学技术出版社，2004:889-917.3Michisch G, Carballido J, Hellsten S, et al. Guidelines on renal cell cancer J. Eur Urol, 2001, 40(3):252-255.4Storkel S, Eble JN, Adlakha
