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1、流感病毒病原学1,（一）形态与结构 球形（80120nm） 丝状、杆状，长短不一,流感病毒病原学2,流感病毒：正粘病毒科，流感病毒属。结构分3部分：包膜、衣壳和核心。78个基因组片段：PB2，PB1，PA， HA（血凝素）， NP，NA（神经氨酸酶），MP，NS。 据NP和MP分型： A型甲型流感病毒 B型乙型流感病毒 C型丙型流感病毒,流感病毒病原学3,（1）血凝素(Hemagglutinin HA) ：（柱形） 凝集红细胞血凝现象，用于鉴定病毒 吸附宿主细胞与受体结合（侵入细胞的关键） 抗原性相应抗体，有中和作用 易变异（分亚型）（2）神经氨酸酶（Neuraminidase NA）：（蘑菇
2、形） 参与病毒释放，促进病毒扩散 抗原性 易变异（分亚型）（3）病毒变异：抗原漂移和抗原转变,亲脂类病毒或中等大小的病毒（如：HSV,CMV,RSV,HIV,HBV）,细菌繁殖体（如：金葡，绿脓）,真菌（如，念珠菌属，曲霉属）,非脂类或小病毒（如脊髓灰质炎病毒 ,柯萨奇病毒）,分枝杆菌（如TB，M.terrae ）,Cryptosporidium parvum 隐孢子虫,细菌芽孢,Prions,敏感,耐受,低效,中效,高 效,灭菌（高，延时）,消毒剂水平,气体灭菌,蒸汽灭菌,理化特性：病毒对乙醇、碘伏、碘酊敏感；对热敏感，5630分钟可灭活。,流感病毒病原学5,宿主范围：人、猪、马、禽类等宿主
3、界限不十分严格，在一定的条件下可突破种间屏障，在不同种间传播动物流感同人类流感关系密切。猪是储存宿主，也可能是“混合器”,流感病毒病原学6,培养特点细胞、动物致病性和免疫性病毒侵入人体后在呼吸道黏膜和肺部繁殖，病毒和其代谢产物进入血液引起相应的临床症状。引起体液和细胞免疫,流感监测目的,（一）监测流感活动水平和流行动态；（二）及时发现流感病毒变异并作出预警；（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。,流感监测内容,（一）流感样病例监测（二）流感样病例暴发疫情监测,流感样病例监测标本采集,采集对象： 流感样病例 发热（体温38），伴咳嗽或咽痛之一者采集时间：病人发病的头3天内采集，最好
4、是24h内采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家哨点医院每周至少采集20份流感样病例的标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时调整）,暴发疫情标本采集,（1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联的死亡病例；（2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内出现流感样病例异常增多。每一起暴发疫情一般应当采集10份咽、鼻拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当全部采样）。,采集标本类型,常规特殊咽拭子 鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子 鼻洗液、
5、含漱液 血清 呼吸道灌洗液 肺组织活检标本 尸检标本,采样液,常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hanks液或MEM；标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素 50 mg/mL，多粘菌素B 250g/mL ）,咽拭子采集,咽拭子 用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。注意：采样前1h内不要进食和饮水，采样液中严禁加入抗生素,标本的保存与运送,标本采集后应在4条件下，尽快（哨点监测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网络实验室未能送至实验室的，应置-70或以下保存，一周
6、内送实验室冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷藏条件下送到实验室,实验室生物安全要求,季节性流感病毒分离鉴定在生物安全级实验室进行。流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全级实验室的生物安全柜里操作。用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全级实验室进行,标本的接收,接收标本时必须核对送检表流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”（表2）录入到“监测信息系统”,标本的处理,标本送至实验室后，立即进行处理，未加抗菌素的加入适量的抗菌素。将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于MDCK细胞接种，一份（1ml
7、）用于鸡胚接种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测程序实时调整）,实验室检测,分子诊断RT-PCR、real-time RT-PCR主要选用的基因片段：M基因-检测A型流感，NS基因-检测B型流感， HA基因-检测禽流感、季节流感H1/H3以及其他亚型病毒分离和血凝抑制试验可用MDCK细胞和SPF鸡胚分离流感病毒，对于高致病性禽流感病毒分离要求BSL-3实验室；可以诊断感染，但无法为临床诊断及时提供结果。快速试纸条法一些商用快速检测可以区分A和B型流感病毒，但是检测季节性流感病毒的灵敏度不佳。因此，快速检测阴性结果可能是假阴性，不能作为禽流感感染的最后诊断。 免疫荧光法免疫荧光试验可以区分A
8、和B型流感病毒 。免疫荧光试验的结果取决于临床标本的质量，操作技能。因此，免疫荧光试验阴性结果可能是假阴性，不能作为禽流感感染的最后诊断。 血清学,季节性流感检测流程,临床标本采集,接种MDCK细胞,接种鸡胚,红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒,红细胞凝集试验,流感病毒核酸检测阳性,PCR鉴定,人感染高致病性禽流感标本实验室检测流程图,呼吸道、尸检标本、其它标本,病毒分离和鉴定,标本采集对象,血清标本,HI试验、微量中和试验、单扩溶血,报告,采集检测第三份血清,双份血抗体滴度4倍增长,核酸检测：RT-PCR或Real-Time PCR，引物至少应包括A、两对H5,再次采样再次检测,按照人流感监测方法
9、分离鉴定,可疑,A及两对H5阳性,阳性,两对H5阴性,阴性,扩增产物序列测定,双份血抗体滴度无4倍增长,报告,报告,核酸检测的原理,核酸提取的原理PCR的原理实时荧光定量PCR的原理,核酸提取的原理,无论是从真核细胞或是从细菌病毒中提取核酸，涉及的基本原理是使细胞膜或细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，再用某些有机溶剂抽提使核酸分离或使核酸吸附于某些颗粒的表面，再进行沉淀或洗脱，从而获取核酸。,核酸提取,核酸提取- QIAamp Viral RNA Mini Kit1）在1.5ml 离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细
10、胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。4）将Viral RNA Mini spin柱子取出，将步骤3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。5）重复步骤4。6）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW l液，8000 rpm离心1min。弃套管及其离心液。7）将吸附柱放入一新的2ml 套管中，加入500ul AW 2液，13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。8）将吸附柱放入一新的1.5ml 离心管中，于柱中加入60ul的AVE液，
11、室温静置13分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即实验或20以下保存。,PCR技术的原理,生物体的遗传物质：核酸（DNA/RNA）碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。人类体细胞中有31亿个碱基对。除了真正双胞胎外, 每个人的DNA是独一无二的, 就好像指纹一样。,PCR技术的原理,PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的DNA片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。特异性：引物序列灵敏度：扩增100万倍,重复13步2535轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA
12、双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,RT-PCR和real-time PCR,RT-PCR：即逆转录PCR，扩增的模板为RNA，增加RNADNA过程。Real-time PCR：即实时荧光定量PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。,双标记探针（Taqman Probe）,荧光定量PCR,第一次使用前引物稀释1引物工作浓度（40M）配制方法：（1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储
13、存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的量为9.1 nmol ，加水量为109.191l）（3）将100M的引物2.5倍稀释，此时浓度为40M，可作为工作浓度。2探针工作浓度（10/20M/）配制方法：（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNase Free Water溶解，加水量为10总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100M，可作为储存液。（3）将100M的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20M，可作为工作浓度。,荧光定量PCR,引物和探针稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；涡旋振荡
14、引物和探针；瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。real-time RT-PCR的试剂QIAGEN公司 QuantiTect Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443 注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。,荧光定量PCR,反应体系和条件试剂：Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitative Kit （公司： Invitrogen，货号：11732-020或11745-100）分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)正反向引物 (40M)双重标记探针(10M)反应条件：逆转录50 30mi
15、n95 2min （95 15s 55 30s*）45反应体系为25ul注：*在55 度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）,荧光PCR结果阳性样品,荧光PCR结果阴性样品,荧光PCR结果可疑样品,病毒分离-MDCK细胞,标本接种MDCK细胞,每日观察细胞病变(CPE),MDCK细胞收获,3335培养,接种流程,清洗MDCK 细胞,临床采样标本接种细胞,Hanks液清洗细胞，一般清洗2遍,3335度吸附12小时,Hanks液清洗细胞,加入病毒生长液，3335度培养箱培养,24小时后，观察细胞病变。当细胞病变为3+或4+时，即75100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融12次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于第7天收获 （细胞病变情况：细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落 ）,
