药物安全性评价-5.局部给药毒性试验

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1、教研室：医学实验动物学姓 名：于 敏联系方式：15904507618,黑龙江中医药大学药物安全性评价中心,第六章 药物安全性评价中局部给药毒性试验,局部用药的毒性实验主要是依据局部用药部位的解剖和生理特点设计的。最常用的局部用药制剂有皮肤用药制剂（涂剂、擦剂、膏药剂、透皮吸收制剂等）、滴眼剂、滴鼻剂和喷雾剂、肌内注射剂、直肠和阴道用药制剂等等,第一节 皮肤给药毒性实验,一.皮肤组织结构 皮肤覆盖于整个体 表组织，由表皮和真皮组成。,二.化学物质对皮肤毒性作用的类型,根据性质不同，由药物引起的皮肤损害包括原发性刺激炎症反应和致敏反应，偶然也可引起皮肤癌。,（一）皮肤原发性刺激 原发性刺激：是指药

2、物直接作用于皮肤引起的病理性反应。只要皮肤接触药物达到一定浓度和时间都有可能产生这种反应。它与皮肤变态反应的不同之处在于初次接触即可发生。 原发性刺激的作用机理可因药物理化性质的不同而不同。可使皮肤角质蛋白溶解出现溶解性坏死（强碱）；可溶解皮脂表面的脂性薄膜，产生脱屑和皲裂（脂溶性溶剂）；皮肤发生溃疡（铬酸盐）；使皮肤蛋白质变性（银、汞、砷等金属盐）。,（二）皮肤致敏 皮肤致敏为变态反应，包括药物致敏和光敏反应。其病理变化特征为不易找到一般毒理学的量效规律；接触后经一定潜伏期，再次接触该药物才能激发出特定症状。 局部用药可导致皮肤致敏反应的药物有抗生素、局麻药、消毒药、某些化妆品等。,（三）皮

3、肤致癌 主要为多环芳烃类和无机砷。,二、皮肤用药毒性实验,（一）皮肤用药急性毒性实验 1.定义： 是指动物完整或破损皮肤一次性接触受试物后在短期内出现的毒性反应实验。 2.受试物：应使用临床制剂，剂量用mg/kg、g/kg或、mg/m2、g/m2表示。如临床制剂浓度无法满足毒性实验的剂量要求，应根据临床制剂的制备标准制备高浓度制剂用于本研究。如果受试物为粉末状，则应用适宜的基质（如凡士林、羊毛脂等）溶解混匀。,3.实验动物及实验条件,每组动物数：家兔、小型猪46只,大鼠或豚鼠10只，雌雄各半 动物体重：家兔23kg，豚鼠200300g，大鼠200250g，小型猪3040kg。 饮食、摄水：自由

4、饮食、摄水，饲料应为适合所选动物的全价颗粒营养饲料，并注明饲料生产商、批号； 动物房温湿度：家兔、豚鼠及小型猪应控制在1826，相对湿度为40%70%；大鼠应控制在2025，相对湿度为40%70%。换气次数应为1020次min。如果用人工光线照明，12h明暗交替。,4.剂量设计,至少应设三个剂量组，剂量设计应足以反映受试物的剂量毒性效应关系，可根据药效剂量及预实验结果确定组间距，一般为0.650.85。另设赋形剂对照组，必要时设空白对照组。如果受试物在拟用临床给药时有可能与破损皮肤接触，则应另设破损皮肤组。,5.实验操作 给药前24h对给药区（通常在背部）进行脱毛处理，给药时将受试物均匀涂于动

5、物脱毛区，如果是液体制剂，则应将受试物涂于敷料上，再贴于脱毛或破损皮肤区，并用半封闭的外罩固定敷料。 涂敷24h后，除去敷料，用温水或适宜的溶剂除去残留的受试物和赋形剂。,6.观察指标（1）观察期：给药后连续观察14d，每天观察1-2次。也可根据出现毒性反应的情况适当延长。 （2）观察指标：给药前及给药后7d、14d称体重，注意观察给药后动物的全身反应，包括皮毛、眼睛、黏膜、呼吸、行为、自主活动、肌张力等，有无颤抖、震颤、抽搐、流涎、腹泻、少动、精神萎靡不振、昏迷等毒性反应症状。若有动物死亡应立即进行尸检，若肉眼检查有明显异常时，应进一步进行病理组织学检查。,7.结果评价,对观察到的阳性症状结

6、合大体解剖或病理组织学结果进行综合分析，与对照组比较，对动物的毒性反应及死亡原因作出明确判断。,（二）皮肤用药长期毒性实验 1.定义 指动物完整或破损皮肤长期反复接触受试物后出现的毒性反应及其可逆程度实验。,2.受试物3.实验动物及条件,4.剂量设计 至少应设三个剂量组，高剂量原则上应使动物产生明显的毒性反应，甚至出现个别动物死亡；低剂量原则上应高于动物药效学实验的等效剂量，并不使动物出现毒性反应；在高剂量和低剂量之间设立中剂量，动物可出现轻度毒性反应。另设赋形剂对照组，必要时设空白对照组。,5.给药期限,6.给药频率 如给药期限3个月，原则上应每天给药；给药期限3个月的药物每周至少应给药6d

7、，也可根据临床给药频率给药。,7.恢复期限 给药结束后应保留部分动物，继续观察其可能出现的延迟性毒性反应，并了解毒性反应的可逆程度。应该根据受试物的药代动力学特点、靶器官或靶组织的毒性反应和实际恢复情况确定恢复期的长短。,8.实验操作,首次给药前24h对给药区（通常在背部）进行脱毛处理（可剪、剃或用适宜的脱毛剂）。每天给药一次，每次至少接触6h。应保证受试物与给药部位具有良好接触并避免动物食入药物。可用纱布等无刺激性辅料包裹或给动物穿上特制的通透性好的外套。,9.观察指标,除增加给药部位皮肤及其周围组织乃至全身皮肤变化和皮肤病理学检查外，其余指标与长期毒性实验要求一样。,10.结果评价,全身毒

8、性反应的结果评价与长毒实验要求一样，应根据各检测指标及病理组织学检查结果综合分析。除此以外还应注意评价给药局部及其周围组织的毒性反应。,（三）皮肤刺激性实验,1.定义 皮肤刺激性：指经皮肤给药后，在皮肤上产生的可逆性炎性病变。若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。皮肤刺激性实验是观察动物的皮肤接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出等局部反应。,2.受试物,应采用与临床应用制剂一致，符合临床用质量标准规定的受试物进行实验，同时注明其名称、来源、批号、含量（或规格）、赋形剂、保存条件及配制方法等，其中赋形剂和杂质等的名称和量应尽可能明确，并附有研制单位的自检报告。所用赋形剂应该标明批号、规

9、格和生产厂家，并符合实验要求。,3.实验动物及实验条件,多种哺乳动物可以选择，一般首选白色家兔，每组动物数48只，雌、雄各半。也可以选用其他种属的动物（如小型猪等），选择家兔和小型猪以外的动物应阐明合理性。,4.实验操作,应设赋形剂对照，采用同体左右侧自身对比法。试验前24h对给药区进行脱毛处理（可剪、剃或用适宜的脱毛剂）。去毛范围左、右各3cm3cm。给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不宜进行实验。进行破损皮肤的刺激性研究时，在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。 受试物药量一般是固体或半固体0.5g，液体0.5ml，直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用两层纱布(2.

10、5cm2.5cm)和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋形剂做对照。贴敷时间至少4h。贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位。多次给药皮肤刺激性实验应连续在同一部位给药，每次给药时间相同，贴敷期限一般不超过4周。,5.观察指标,在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。按表6-2给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。,6.结果评价,单次给药皮肤刺激性实验：计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值，按表进行刺激强度评价。多次给药皮肤刺激性实验：首先计算每一观察时间点各组积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物积分均值，按表进行刺激

11、强度评价。,（四）过敏性实验,过敏反应（也称变态反应）：是指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应，是异常或病理性免疫反应。 过敏反应有以下特点：其组织损伤不同于一般毒性反应，表现为变态反应性炎症；初次接触抗原后可不出现明显毒性反应，但经过一定时间后再次接触同一物质，即可出现明显反应。无明显剂量效应关系有时很小剂量就可出现剧烈反应。,1.皮肤过敏性实验2.啮齿类动物局部淋巴结实验3.被动皮肤过敏实验4.皮肤光毒性实验5.皮肤光过敏反应实验6.全身主动过敏实验,（五）皮肤涂抹致癌实验,1试验目的 通过动物皮肤反复、长期涂抹受试物质，观察有无致癌作用。2试验材

12、料（1）动物 目前认为以BALB/C、C3H及DBA等品系较敏感。性别以雌性为宜，可减少因咬斗而致的皮肤损伤。鼠龄35周。实验前，需在检疫室中观察l2周，喂食1%四环素水。（2）受试物 若受试物为固体粉末，助溶剂多采用丙酮。（3）阳性对照药 苯并芘，开始一次给400g，后重复给予促癌剂TPA（巴豆油提炼物）每周每只30g，连续3035周。按此法，乳头状瘤发生率可达50%。,第二节 腔道给药的毒性实验,一、腔道给药的急性毒性实验（一）定义 指通过动物腔道（包括眼、耳、鼻腔、直肠、阴道）一次性接触受试物后在短期内出现的毒性反应实验。,（二）受试物 应使用临床制剂，如临床制剂浓度无法满足毒性实验的剂

13、量要求，应根据临床制剂的制备标准制备高浓度制剂用于本研究。如为滴鼻剂或吸人剂，则受试物多为液体或粉剂；如为直肠、阴道用药，受试物多为栓剂、液体或膏剂，若受试物为粉末状，则应用适宜的基质 （如凡士林、羊毛脂等）溶解混匀。,（三）实验动物及实验条件 滴剂或吸入剂急毒实验一般选择大鼠或豚鼠、家兔；需直肠、阴道用药时应选择大鼠或家兔。其中大鼠应选择SPF级动物。如选择其他动物应充分说明其理由。每组动物：家兔46只，大鼠或豚鼠10只，雌雄各半。动物体重：家兔23kg，大鼠、豚鼠250300g。,（四）剂量设计（五）实验操作（六）观察指标（七）结果评价,二、腔道给药的长期毒性实验 对经直肠、阴道给药的受试

14、物，应根据其药效作用特点及临床用药方案，选用家兔、大鼠或beagle犬进行长期毒性实验，给药途径应尽量模拟临床给药途径，每次药后保留时间尽量与临床一致，确保药物与给药局部的接触时间。给药剂量、给药期限、恢复期限及观察指标可参考长期毒性常规要求。应特别注意观察给药局部及可能累及的周围组织的反应和病理改变。,第三节 刺激性实验,一.定义 刺激性：是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症反应，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。 刺激性实验：是观察动物的血管、肌肉、皮肤、黏膜等部位接触受试物后是否引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应。包括眼刺激性实验、血管刺激实验、肌肉刺

15、激实验、直肠刺激实验、阴道刺激实验、滴鼻剂和吸入剂刺激性实验 、口腔用药和滴耳剂刺激性实验 等,第四节 溶血性实验,溶血性实验：观察受试物是否能引起溶血和红细胞凝聚 等反应。,二、注意问题1.实验动物的选择 依据拟采用的实验模型和观察指标选择实验动物，一般每个实验选择一种动物进行评价。2.给药的频率与期限 给药的频率与期限应依据拟定临床应用的情况来决定。重复给药的制剂，一般每天给药一次，给药期限最长不超过四周。单次给药的制剂可用单次给药的方法进行实验。3.可逆性观察 为明确毒性反应的性质，建议进行停药后恢复期的观察。局部毒性反应的可逆性评价应包括局部及相关部位的反应。,4.受试物 受试物应与临

16、床应用制剂一致。5.对照组 以溶媒和/或赋形剂作阴性对照，必要时用已上市制剂作对照。6.剂量 剂量设计主要应该考虑受试物浓度和总剂量。一般采用与临床制剂相同浓度，设一个剂量组，可以通过改变给药频率进行剂量的调整，必要时应该进行不同浓度的刺激性实验。对于皮肤刺激性实验，在给药面积不变的情况下，不应通过增加厚度来满足增加给药量的目的。,7.给药方案 给药方案原则上应与临床用药方案一致，但设计给药容积、速率和频率时，应考虑所选用动物模型给药部位的解剖和生理特点。可在同一动物身上进行不同给药途径的刺激性实验，并可在对侧进行对照实验。条件是耐受性许可和无相互影响。8.统计处理 根据实验模型和实验方法选择合适的统计方法。,