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1、1肝细胞癌组织芯片环氧合酶-2 表达的半定量图像分析【摘要】 目的 分析环氧合酶-2(COX-2)在肝细胞癌(HCC)中的表达及意义。 方法 应用改良的手工制备组织芯片方法制备含 150 例肝细胞癌、92 例癌旁肝硬化、45 例癌旁慢性肝炎以及 37 例肝内转移灶和 13 例正常肝组织的组织芯片,结合免疫组织化学染色和图像分析技术检测 COX-2 蛋白的相对表达量。 结果 COX-2 蛋白在 HCC表达显著低于癌旁肝硬化、癌旁慢性肝炎(P0.01)，但高于正常肝组织(P0.05),差别具有统计学意义。在 HCC 组织中, 低分化HCC 的 COX-2 表达量显著低于高分化的 HCC,差别有统计
2、学意义(P0.05)。 结论 COX-2 在 HCC 的发生中发挥重要作用,并与 HCC 的分化程度密切相关 ,但与 HCC 进展及侵袭转移关系不大。 【关键词】 前列腺素内过氧化物合酶; 肝肿瘤; 癌,肝细胞; 芯片分析技术; 免疫组织化学; 图像处理,计算机辅助ABSTRACT: Objective To detect the expression of cyclooxygenase-2(COX-2) in hepatocellular carcinoma(HCC). 2Methods Tissue chips were constructed by modified manual too
3、ls, which contained 150 HCC samples, 92 cirrhotic livers adjacent to HCC samples, 45 chronic hepatitis livers adjacent to HCC samples, 13 normal liver tissue samples and 37 intrahepatic metastasis lesion samples. The expression of COX-2 was determined by immunohistochemistry and semi-quantitative im
4、age analysis. Results The expression of COX-2 in HCC was lower than that in cirrhotic liver adjacent to HCC tissue or chronic hepatitis tissue, but higher than that in normal liver tissues(P0.05). Conclusion COX-2 might play an important role in the process of HCC tumor genesis and the differentiati
5、on of HCC, but not related with invasion and metastasis.KEY WORDS: prostaglandin-endoperoxide synthase; liver neoplasm; carcinoma,hepatocellular; microchip analytieal procedures; immunohistochemistry; image processing,computer-assisted3计算机图像处理系统的诞生是计算机技术与形态影像为主的学科相结合的结果,使得定量病理学得到长足发展。目前,彩色图像分析系统已较广泛
6、应用于免疫组织化学结果的分析中1 。福建省是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)高发的省份。笔者应用组织芯片和图像分析技术检测环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在 HCC 的表达情况,探讨其与各临床病理参数的关系及意义。1 材料与方法1.1 对象 收集福建医科大学附属第一医院 20002006 年手术切除的 HCC 标本 150 例, 癌旁肝硬化 92 例,癌旁慢性肝炎 45 例,肝内转移灶(卫星灶和门静脉癌栓)37 例。所有病例均经病理诊断证实,术前均未进行化疗及放疗。HCC 病例按 Edmondson 组织学分级法分为级：级为高分化
7、,级为低分化;并判断有无包膜侵犯以及肝内外转移等情况,病理参数见表 1。另收集 13 例正常肝组织。所有标本经 10福尔马林固定,常规石蜡包埋备用。1.2 主要试剂 兔抗人 COX-2 浓缩型多克隆抗体(美国 Cayman公司, 美国 University of Texas-Houston Health Science Center Ruan KH 实验室惠赠); ElivisionTM plus 二步法试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。41.3 方法1.3.1 肝细胞癌组织芯片制备 应用改良的手工制备组织芯片的方法制备含肝细胞癌、癌旁肝硬化、癌旁慢性肝炎以及肝内转移灶和正常肝组织的组织芯片
8、3,其基本过程包括用特制的模具定位、打孔针在受体蜡块打孔、取样针在供体蜡块取样及按预先设计的顺序准确点样。以 4 m 连续切片,温水裱片,敷贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片。取其中一张行 HE 染色供形态学观察。1.3.2 免疫组织化学染色 高压抗原修复 ,采用 ElivisionTM plus二步法,据试剂说明书操作, 一抗 COX-2 工作浓度为 1100,以 PBS代替一抗作为阴性对照,DAB 显色,苏木精对比染色。1.3.3 结果判断 COX-2 蛋白定位于细胞胞质 ,阳性产物为棕黄色。1.3.4 图像分析 采用摄像生物显微镜(BH-2，日本 Olympus 公司)在 400 倍视野下对芯
9、片上每个点的阳性区域拍照,每例标本取 5个视野;应用彩色图像分析系统(Image-Pro Plus 5.0,美国 Media Cybernetics 公司)以显微镜定标尺定标,光密度校正,在 HIS 颜色模式下选中阳性区域,挖除核染色, 并转换为灰度图,使背景填充白色, 测定每个视野的积分光密度(integral optical denisity,IOD)值, 传入5excel 表中 ,取平均值代表标本蛋白的相对量,以进行半定量分析;第 1张图处理完毕将整个分析过程录制成宏程序,后续分析图像,按照宏程序自动分析完成。1.4 统计学处理 所得计量数据以 xs 表示 ,采用 SPSS 11.5 统
10、计软件包对数据进行单因素方差及 t 检验分析,以 P0.05 为差别具有统计学意义。2 结 果2.1 COX-2 在 HCC 等 4 种组织的定性表达 COX-2 蛋白阳性信号定位于细胞质,在高分化 HCC 中癌细胞为弥漫性阳性 ,在低分化HCC 及肝内转移灶中弱表达或不表达 ,在癌旁肝硬化、癌旁慢性肝炎组织中表现为局灶肝细胞阳性,在正常肝组织无表达或微弱表达(图 1)。2.2 COX-2 在 HCC 等 4 种组织的半定量表达 COX-2 蛋白在HCC 组、癌旁肝硬化 (肝硬化组)、癌旁慢性肝炎(肝炎组)以及正常肝组织(正常组 )相对表达量分别为 (103):(1.211.34),(3.38
11、1.46),(3.011.29),(0.210.33);COX-2 蛋白在 HCC 组表达显著低于硬化组、肝炎组(P0.01),但高于正常组(P0.05),差别有统计学意义(图 2)。62.3 COX-2 在 HCC 中的表达与 HCC 临床病理学参数的关系 COX-2 蛋白在 HCC 中表达情况见表 1。低分化 HCC 的 COX-2 表达量显著低于高分化的 HCC,差别有统计学意义 (P0.05)。COX-2 蛋白的表达与性别、肿瘤大小、组织学类型、转移无关(P0.05)。3 讨 论COX-2 是一种诱导型环氧合酶 ,静息时不表达 ,当受到生长因子、丝裂原等多种因素诱导时,表达上调, 其活
12、性可增加数十倍4 。大量研究表明 COX-2 不仅是炎症反应的重要环节 ,而且在胃癌、结肠癌等大多数恶性肿瘤中呈高表达,并与恶性肿瘤的形成及发展密切相关5-6 。COX-2 与 HCC 的关系一直是近年来研究的热点 ,但 COX-2 在HCC 中表达的情况报道尚不一致。 Callejas、朱道奇等发现 COX-2在 HCC 呈高表达,与 HCC 进展及侵袭转移密切相关7-8 。而Koga、Morinaga 等发现 COX-2 在癌旁组织表达明显高于 HCC,在高分化 HCC 中表达明显高于低分化 HCC,提示 COX-2 可能参与HCC 发生的早期阶段 ,并与 HCC 分化密切相关9-10 。
13、本研究利7用含 150 例 HCC 的组织芯片, 结合免疫组织化学及彩色图像分析技术, 研究结果显示 COX-2 在 HCC 中表达明显升高,但随着癌细胞分化程度降低,COX-2 蛋白相对表达量明显下降,且 COX-2 的表达与HCC 患者年龄、肿瘤大小、组织学类型、包膜侵犯以及转移均无关,提示 COX-2 在 HCC 的发生中发挥表 1 COX-2 蛋白在肝细胞癌的表达与临床病理学参数的关系重要作用,并与 HCC 的分化程度密切相关, 这与 Koga、Morinaga 等的报道是一致的 9-10 。本研究还发现 COX-2 在 HCC 原发灶和转移灶中表达无明显差别,推测 COX-2 与 H
14、CC 侵袭转移及预后关系较小。研究发现在肝细胞癌发生的早期阶段其病理学分级一般为高分化,随着病情的进展,HCC 分化程度向中、低分化方向发展 ,在转移灶中HCC 分化程度比原发灶更低 11-12 。本研究结果提示 COX-2 参与了 HCC 发生的早期阶段 ,这对探讨多阶段、多步骤形成 HCC 机制有一定的意义。【参考文献】 1 Kew M C. Epidemiology of hepatocellular carcinomaJ. Toxicology, 2002,(181-182):35-38.2 OLeary T J. Standardization in immunohistochemi
15、stryJ . Appl Immunohistochem Mol 8Morphol, 2001,9(1):3-8.3 臧盛兵,黄爱民,高凌云,等. 手工制作组织芯片方法的改良及其在肝细胞癌研究中的应用J. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2007,16(3):251-253.4 Trifan O C,Hla T. Cyclooxygenase-2 modulates cellular growth and promotes tumorigenesisJ . J Cell Mol Med, 2003,7(3):207-222.5 Tatsuguchi A,Matsui K,Shinji Y,et al. Cyclooxygenase-2 expression correlates with angiogenesis and apoptosis in gastric cancer tissueJ
