《第2章 基因工程的酶学基础》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第2章 基因工程的酶学基础（116页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、,第二章 基因工程的酶学基础,Enzymes,第一节 限制性核酸内切酶,第二节 DNA 连接酶,第三节 DNA聚合酶,第五节 核酸外切酶,第六节 单链DNA内切酶,第四节 DNA修饰酶,一、限制性核酸内切酶,第一节 限制性核酸内切酶,是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。,（Restriction endonuclease）,2. 性质,内切酶。,原核生物。,即在核酸分子链的内部制造切口的酶。,自我保护作用。,3. 功能,细菌的限制和修饰系统（R/M体系）,1. 来源,细菌的限制修饰现象,限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成
2、小片段。,（1）限制（Restriction）,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰（Modification）, Dam甲基化酶,GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基。, Dcm甲基化酶,CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基。,大肠杆菌细胞内的两种甲基化酶：,I 型限制性内切酶,目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。,二、限制性内切酶的类型,II 型限制性内切酶,III型限制性内切酶,首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。,（1）识别位点序列,EcoB： TGA(N)8
3、TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,1. I型限制性内切酶,如 EcoB和 EcoK。,未甲基化修饰的特异序列。,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,（3）作用机理,在距离特异性识别位点约1000-1500 bp处随机切开一条单链。,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割位点,首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。,（1）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。,2. II型限制性内切酶,分离的第一个酶是Hind ,（2）切割位点,切开双链DNA。
4、形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：,识别位点处。,（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个核苷酸单链的末端。,分两种类型：, 5端凸出（如EcoR I切点）,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCAG, 3端凸出（如Pst I切点）,GACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA G,G ACGTC, 连接便利,（4）粘性末端的意义,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子
5、内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,这比连接两个平齐末端容易的多。, 补平成平齐末端,粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。,识别位点的序列相同的限制性内切酶。,（5）同裂酶（Isoschizomers), 完全同裂酶：,识别位点和切点完全相同。 如Hind 和Hsu I。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。, 不完全同裂酶：,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等,（6）同尾酶(Isoca
6、udamers）,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl ,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho ,U代表嘌呤；Y代表嘧啶。,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,？,5-G 3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl ,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl ,Sau 3A,（GGATCC）,（AGATCT）,限制性内切酶的识别和酶切
7、活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。,（7）限制酶的酶活性,如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。,所以一般使用专一的反应缓冲液。,星号（*）活性（ Star activity ）,EcoR I和BamH I等都有*活性。,在高浓度甘油、低盐、高pH(8)时可识别和切割,GAATTA、AAATTC、GAGTTC等,GAATTC,EcoR I：,使用的时候要特别注意！,3. III型限制性内切酶,在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,在基因工程操作中用途不大。,EcoP1: AG
8、ACC,EcoP15: CAGCAG,限制性核酸内切酶的类型及主要特性,1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：,三、限制性内切酶的命名,用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。,大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。,4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。,2. 用一个右下标的字母表示菌株。如Hind（现在都写成平行，如Hind）。,3. 如果一种特
9、殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如Hind II、Hind III 。,DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。,1. DNA的纯度,四、影响限制性内切酶活性的因素,纯化DNA 加大酶的用量 延长保温时间 扩大反应体积（ 20l）,一般采取,大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：,2. DNA的甲基化程度,dam甲基化酶（修饰GATC中的A），受其影响的酶如Fba I、Mbo I等。dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG中的C），受其影响的酶如Sfi I等。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。
10、大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。,3. 温度,4. DNA的分子结构,限制性内切酶切割线形DNA分子的效率明显高于切割超螺旋质粒DNA和环状病毒DNA的效率。,是影响限制酶活性的重要因素。,5. 缓冲液(Buffer),缓冲液的化学组成,MgCl2： 提供Mg2+ ；NaCl（50-150mM）/KCl ： 提供离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）： 保持酶的稳定性； 牛血清白蛋白BSA等： 有助于酶的稳定。,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,6. 酶的用量,1 U 限制性内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解 1 mg lDNA
11、所需的酶量。,酶的用量不能超过反应总体积的1/10！,五、限制性内切酶对DNA的消化,1. 内切酶与识别序列的结合模式,1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。,GAATTC,CTTAAG,内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。,2. 完全消化,1,2,3,4,1,2,3,4,（1）单酶切,（2）双酶切,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切；对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：, 使用较贵酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；, 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；, 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。,i.
12、0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4,ii. 2倍体积的无水乙醇,iii. 冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,只有有限数量的酶切位点被切开。,通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。,3. 局部消化,1,2,3,4,1,4,大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。,4. 限制酶酶切反应的终止,5. 几种常用限制酶识别位点,第二节 DNA 连接酶,一、DNA连接酶（ligase）的特点,（1）大肠杆菌连接酶,1. 两种DNA连接酶,只能连接粘性末端。,（2）T4噬菌体的连接酶,不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。,（1）必须是
13、两条双链DNA。,（2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。,（3）需要能量。,动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+,2. 连接条件,3. 连接反应,连接酶催化双链DNA分子上相邻的3 -OH与5 -P形成磷酸二酯键。,1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。,二、连接反应的机理,2. ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。,3. AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。,OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+,+H3N,AMP,ATP,PPi,4. AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-
14、腺苷酸”复合物。,-OH,HO-P-,AMP,-OH,O-P-,AMP,5. 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，释放出AMP。,连接酶反应的最佳温度是37C。,三、连接反应的温度,1. 最佳温度,但在37下粘性末端的结合很不稳定。,2. 实用温度,所以一般采用 416 C。,增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,1. 插入片段与载体的分子比,2. 反应温度,四、影响连接反应的因素,5 : 1 - 10 : 1,一般1416,五、平齐末端的连接,提高平齐末端连接效率的方法包括：,1. 加大连接酶用量,2. 加大平头末端底物的浓度,3. 加入10% PEG8000,4.
15、 加入单价阳离子（NaCl）,第三节 DNA聚合酶,一、基因工程中常用的DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶I 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶7. Taq DNA聚合酶,1. 共同特点,把dNTPs连续地加到引物的3-OH端。,2. 主要区别,二、常用的DNA聚合酶的特点,持续合成能力和外切酶活性不同。,3. 常用DNA聚合酶的特性比较,三、DNA聚合酶在基因工程中的用途,1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I,主要用来制备带标记的DNA探针。,（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质,一条单链多肽。,53外切酶活性位于N端。,用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。,
