原生质体培养

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1、第八章 原生质体培养,目的与要求 掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握植物原生质体的培养方法及其特点，以及存活率、密度、产量的测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植株的鉴定方法。 具备原生质体分离、纯化基本认知，具有原生质体培养基本能力，能够理解原生质体融合概念及方法。,原生质体：原生质体去掉细胞壁的由质膜包裹着的裸细胞。,一、原生质体概念,1、原生质体没有细胞壁，有利于细胞融合，体细胞杂交，基因转移和单细胞培养。2、原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质，作为理想的受体系统进行各种遗传操作的研究，

2、实现体细胞杂交在植物遗传育种方面的应用。,二、原生质体培养意义：,一、原生质体的分离（一） 植物细胞壁的结构及其化学组成 1、植物细胞壁：初生壁：纤维素、半纤维素、果胶 次生壁：纤维素、半纤维素 2、相邻细胞的初生壁间有中层（胞间层）： 果胶酸钙、果胶酸镁 果胶化合物是一种可塑性大且高度亲水的交替，可使相邻细胞粘在一起，并有缓冲作用。,第一节 原生质体的分离与纯化,（二） 降解细胞壁的酶类 用于植物原生质体分离的酶类：纤维素酶：半纤维素酶：果胶酶：,（三） 材料来源1、来源 叶片，花瓣，果实组织，花瓣髓部，子叶等，尤其是叶肉细胞及由各部分形成的培养细胞和悬浮细胞。2、预处理1）低温处理2）等渗

3、溶液处理,1、机械分离法 产生质壁分离释放原生质体缺点： 原生质体的产量很低；方法繁琐费力；因必须高度质壁分离，故局限性大。优点： 能够排除外加酶对离体原生质体的结构和代谢活性的有害影响。,（四）分离方法,2、酶分离法 收率高、活力强、完整性好。分离原生质体最有效。（1）酶的种类及特点 分离原生质体的酶多是一些复合酶制剂，以其所含的主要酶的作用分为： 1、纤维素酶类 2、半纤维素酶类 3、果胶酶类 4、崩溃酶 5、蜗牛酶,（2）酶液的配制1、酶的配比和浓度2、渗透压和稳定剂及PH。,（3）分离原生质体1、两步分离法。用果胶酶离析植物组织，收集细胞，经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁，然后获得原生质体

4、。2、一步分离法。一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。,叶肉原生质体分离纯化,纯化后的叶肉原生质体,1、沉降法（过滤离心法）：低速离心使原生质体沉于底部。2、漂浮法：根据原生质体和细胞或细胞碎片的比重不同，分离出原生质体。3、不连续梯度离心法：在离心管中首先放入不同浓度的Ficoll溶液，构成不同梯度，在上部滴入1-2ml酶原生质体混合液，在150g离心5min，不同比重的原生质体漂浮在不同的浓度梯度的界面上，用吸管手机原生质体，悬浮洗涤备用。,二、原生质体的纯化,1、荧光素二乙酸法2、染色识别 用0.1%酚番红或Evans蓝进行染色。3、形态识别 形态上完整，含有饱满

5、的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。,三、原生质体活力的测定,1、供试材料 一般选用继代后 处于旺盛分裂时期的淡黄色、颗粒状的愈伤组织、悬浮细胞系或生长健壮植株上的较幼嫩外植体。2、酶的种类、组合和酶解时间 选择纯度高的酶类，根据酶解材料细胞壁的特性及酶活性大小确定适宜的酶液组合。酶浓度不宜过高，酶解时间不宜过长，最好不超过8h。木本植物细胞壁成分坚厚，半纤维素较多，适当添加半纤维素。,四、影响原生质体数量和活力的因素,3、渗透压稳定剂 主要有两类：一类由糖醇或可溶性糖组成的有机溶液，目前大多采用这一类，一般使用甘露醇或山梨醇，也有的使用蔗糖，使用甘露醇者最多。一类是无机盐类，由氯化钙、硫

6、酸镁、氯化钾或培养基中的无机盐组成。优点是原生质体的产量高，缺点是可降低细胞壁降解酶的活性，使高浓度的无机盐进入细胞内，从而影响培养效果。,四、影响原生质体数量和活力的因素,4、质膜稳定剂 为了提高质膜的稳定性和增加原生质体的产量，可在酶液中添加多聚阳离子和无机钙离子作为质膜稳定剂。一般添加0.5%-1.0%的葡聚糖硫酸钾或0.1%氯化钙。,四、影响原生质体数量和活力的因素,5、PH酶液的PH对原生质体的产量和活力影响很大，因植物材料不同要求也不同，一般为5.5-5.8。如原生质体的供体材料是植物器官，酶液中应加入PH缓冲剂，以维持稳定酶液的PH，一般添加0.05-0.1%磷酸盐或3.0-5.

7、0mmol/L MES.,四、影响原生质体数量和活力的因素,一、培养基1、碳源：葡萄糖2、氮源：谷氨酰胺3、生长物质：生长素与细胞分裂素4、钙源：可增强稳定性，提高分裂频率，明显改变细胞质内外的离子交换。5、渗透压：高渗溶液，培养时一般逐步过渡，通常的渗透剂是甘露醇和山梨醇。6、PH5.66.0，醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌,第二节 原生质体培养,二、培养方法,1、液体浅层培养 原生质体（约2105/ml密度）悬浮在液体培养基将悬浮物质移到直径为60cm的平皿中（2-3mm为宜）5-10天后开始原生质体分裂 特点：通气好，原生质体代谢物易扩散，防止有害物质积累过多造成毒害，转移添加新鲜培养基方便，

8、便于观察和照相。操作简单，可微量培养，细胞植板率高。但原生质体沉淀，分布不均，细胞团聚集多，难成单细胞株系。,2、平板法培养 原生质体（密度为4105/ml）与等量体积琼脂糖培养基均匀混合置于6cm培养皿（2-3mm）,暗培养5-7天原生质体开始分裂 特点：原生质体分布均匀，利于分裂，容易获得单胞株系，可定位观察。原生质体易受热伤害，易破碎，原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢，植板率低。,3、悬滴法培养 将含一定密度原生质体的悬浮液，滴在6cm培养皿盖内侧上，皿底加入培养液和渗透剂等液体保湿，此时培养小滴悬挂在皿盖内。 特点：用材少，培养液消耗少，利于通风与观察，可做原生质体不同密度的

9、培养对比试验，进行单细胞培养。,4、双层培养法 固体培养和液体培养浅层培养相结合的方法，效果最佳。原生质体采用平板培养方法包埋在培养皿底层，上面再加入相同成分的液体培养基，暗培养。需更换新鲜液体培养基。 特点：原生质体分布均匀，有利于分裂，易获单细胞株系，能除去抑制分裂的有害物质，细胞植板率高。原生质体易受热伤害，易破碎。,5、饲喂培养法 将饲喂的细胞用培养基作平板，此平板称饲喂层，用X射线或紫外线照射，使核失活但细胞存活，然后将原生质体以液体浅层培养或平板技术铺在饲喂层上。 特点：以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层没有种的特异性。,原生质体培养程序示意图,三、原生

10、质体存活率、密度及产量的测定,（一）双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数100（二）测定原生质体的密度 原生质体的密度（个/ml）=（原生质体数/1区域）104稀释倍数,（三）原生质体产量的测定 Y=DV / FW Y（个/g）原生质体产量 D（个/ml）存活原生质体密度 V（ml）制备所得原生质体悬液的总体积 FW（g）制备原生质体所用材料的鲜重,四、影响原生质体培养的因素,1、原生质体活力 选择生长健康植株上的外植体，或分裂旺盛的愈伤组织或悬浮细胞，在酶解处理时酶制剂浓度不要过高。2、原生质体起始密度 一般起始密度为5000-10000个/ml，看护培养可降

11、低培养密度。3、渗透压稳定剂 在原生质体培养中除用2-3%蔗糖作为稳定剂外，还使用0.3-0.5mol/l的甘露醇。有的用葡萄糖完全或部分取代甘露醇，效果也很高。,五、影响原生质体培养的因素,4、培养基成分 1）基本培养基：MS,B5，Nitsch、N6、KM-8P 2）碳源：葡萄糖（大多数用） 3）无机盐浓度和氮形态：无机盐浓度不宜过高，尤其铵态氮浓度不宜过高。 4）植物生长调节剂的浓度配比：5、培养条件 光照：原生质体培养初期不需要光照，采用暗培养，当形成细胞团后在光下培养，强光抑制细胞分裂 温度:2616、植物材料和基因型,第三节 原生质体融合,也称体细胞杂交，就是分离下来的不同亲本杂交

12、的原生质体，在人工控制下，像性细胞受精作用那样互相融合成一体。 自然条件下，原生质体自然融合频率极低，必须加以一定的方法诱导，才能促进原生质体的融合。,原生质体融合,甘薯原生质体融合植株,二、原生质体融合的方法和过程（一）无机盐诱导融合 硝酸钠（二）聚乙二醇（PEG）诱导剂与高钙相结合的诱导融合 1、PEG诱导剂溶液配制：分子量为4000-6000。 2、高Ca2+-高PH液 3、原生质体培养基：NT与MS,4、融合过程（1）收集原生质体（2）滴150ul混合双亲的原生质体悬浮液于载体玻片上，形成一层薄层。（3）吸取PEG融合诱导液450ul,使PEG溶液逐渐与原生质体接触，促使原生质体相粘连

13、。（4）保温后，取高Ca2+-高PH溶液0.5ml，滴入原生质体悬浮液与PEG混合液中。,（5）吸取2ml原生质体培养基洗涤PEG处理过的原生质体5次。（6）在载玻片上的材料上，加上一层原生质体生长所须的培养基（7）融合百分率计算 融合百分率=融合数目/两亲本原生质体总数100%,完整洋葱原生质体（40）,完整烟草原生质体（40）,（三）电融合技术 1、将原生质体悬浮液离心，去上清，用电击液（10%甘露醇，0.1mmol/L醋酸钙，0.5mmol/L醋酸镁） 2、对电融合仪的交变电场频率，高压方波幅值和持续时间、次数、间隔时间进行预先设置试验。 3、取1-2滴悬浮液与电融合仪极间。 4、1-2

14、min后，给予瞬间的高度电脉冲。,三、杂种细胞的筛选与鉴定 （一）互补筛选1、白化互补选择法2、营养缺陷型互补选择3、抗性互补选择4、代谢互补仰制选择（二）机械分离杂种细胞法法（三）双荧光标记选择法,双荧光素标记,作业：1、说明机械分离法和酶分离法的特点2、原生质体纯化方法有哪些？原生质体活力的测定方法有哪些？3、简述原生质体五种培养方法及特点4、原生质体融合有哪几种方法？,四、杂种植株的鉴定1、形态学鉴定2、细胞学观察 3、DNA内切图谱分析法 4、同工酶分析法,思考题：1、说明机械分离法和酶分离法的特点2、原生质体纯化方法有哪些？原生质体活力的测定方法有哪些？3、简述原生质体五种培养方法及特点4、原生质体融合有哪几种方法？,