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1、水稻独脚金内酯有关基因之图位克隆与性能分析第一章绪论植物激素是植物生长和发育的重要的调控因子，经典的植物激素包括生长素(Auxin) 、赤霉素(Gibberellin, GA)、细胞分裂素(Cytokinins, CK)、乙烯(Ethylene) 、脱落酸 (Abscisic acid, ABA)，以及近些年鉴定的油菜素内酯(Brassinosteroids, BRs)、茉莉酸(Jasmonates, JA)和水杨酸(Salicylic acid,SA)，此外还存在一些被广泛认为有植物激素作用或植物激素信号分子作用的物质，一氧化氮(Nitric oxide, NO)，多肽(Peptide)，葡
2、萄糖(Glucose)等物质( 熊国胜等, 2009; Santner and Estelle,2009)，这些激素共同调控着植物的生长以及参与植物发育的过程(Mcsteen and Zhao, 2008)。独脚金内酯(Strigo lactones, SLs)是由法国和日本的两个研究小组于 2008 年发现的一种新型植物激素，它能抑制植物分枝的生长(Gomez-Roldan et al., 2008; Umehara et al., 2008)，并与生长素和细胞分裂素共同调控植物分枝的发育(Hayward et al., 2009; Stirnberg et al., 2010)。SLs 是
3、一类萜内酯(Terpenoid lactone)，它从植物的根中释放，可诱导根寄生植物(Root parasitic plants)种子如独脚金属(Striga spp.)中独脚金(巫婆草) 、列当属(Orobanche spp.)中列当的萌发，以及丛枝真菌(Arbuscular mycorrhiza, AM)菌丝(Hyphae)的分枝(Tsuchiya and McCourt, 2009; Xie et al., 2010; Yoneyama et al.,2010)，最近报道 SLs 还参与了植物根的发育(Koltai, 2011)以及调控苔藓菌落的生长(Proust et al.,201
4、1)。独脚金内酯的研究才刚刚开始，SLs 在植物发育以及生物共生关系中还起着什么作用，SLs 的合成和信号途径都不是很清楚，目前对独脚金内酯的认识还知之甚少。1.1 独脚金内酯的发现独脚金内酯是一类萜内酯，它作为根寄生植物独脚金属(Striga spp.)、列当属(Orobanche 和 Phelipanche spp.)和黑蒴属(Alectra spp.)的萌发刺激物(Germination stimulants) 最初被分离于植物根部的渗出物(Xie et al., 2010; Yoneyama et al., 2010)。Cook 等第一次从陆地棉(Gossypium hirsutum)
5、根分泌物中分离出了这种对独角金种子有刺激萌发作用的物质，并命名为独脚金醇(Strigol)(Cooket al., 1966,1972)，不久在玉米(Zea mays) (Siame et al., 1993), 高粱(Sorghum bicolor) (Hauck et al.,1992)和藜(Pennisetum glaucum) (Siame et al., 1993)中分离出 strigol (图 1.1)。高粱内酯(Sorgolactone)是另外一种在高粱中被鉴定的 SLs 家族成员(Hauck et al., 1992)。黑蒴醇(Alectrol), 列当醇(Orobanchol
6、)以及第三种从未被鉴定的化合物在红三叶草中被分离得到(Trifolium pretense) (Yokotaet al., 1998)它们都能诱导独脚金种子的萌发。更有趣的是黑蒴醇这种萌发刺激物也在牛豆(Vignaunguiculata)产生，并且诱导 S.Gesnerioides 的萌发(Muller et al., 1992)。最近从 Phelipanche ramosa 的寄主烟草(Nicotiana tabacum)的根分泌物中分离出来 2-epiorobanchol 和 solanacol (Xie et al.,2007)，此外从几种禾本科植物、茄科植物和番茄(Solanum ly
7、copersicum)中分离出两种具有生物活性 的 物 质 sorgomol (Xie et al., 2007; Awad et al., 2006) 和 独 脚 金 醇 的 脱 氢 异 构 体(Didehydro-orobanchol isomer) (Sato et al., 2003)，最近 5-脱氧独脚金醇(5-deoxystrigol)被鉴定作为百脉根(Lotus japonicas L.)根培养物的代谢物能促进丛枝真菌菌丝的分枝(Akiyama et al., 2005)，这些与独脚金醇相关的萌发刺激物被统称为独角金内酯(Strigolactones, SLs) (Yoneyam
8、a et al., 2008)(图 1.1)。1.2 独脚金内酯的生物合成独脚金醇(Strigol)是独脚金内酯 (SLs)的主要成员之一，SLs 已经从大量的单子叶和双子叶植物的根分泌物中分离，广泛存在于植物界中(Matusova et al., 2005)。这些化合物基本结构单元是三环内酯(Tricyclic lactone) ABC 部分(图 1.1)，它通过烯醇醚键(Enol ether bridge)连接丁烯酸内酯 (Butenolide, D-ring)，D 环在这些化合物的生物活性是必须的(Mangnus and Zwanenburg, 1992;Wigchert and Zwa
9、nenburg, 1992; Yoneyama et al., 2008)。这些复合物在 A 环上有一个或两个甲基基团并且在 A/B 环部分上有一个或更多的羟基(Hydroxyl)或乙酰基(Acetyloxyl)。天然产生的 SLs 在环乙基(Cyclohexyl )A 环都拥有至少一个甲基取代基(Methyl substituent)以及围绕 A 和 B 环部分可变的羟基化(Hydroxylation) (Xie et al., 2010)。现在已知 SLs 是一类倍半萜稀内酯 (Sesquiterpene lactones)(Humphrey and Beale, 2006) ，它们都源于
10、萜类 (Tterpenoids)/ 类异戊二烯 (Isoprenoids) 途径(Bouwmeester et al., 2003) ，萜类化合物和异戊二烯的合成是由异戊烯二磷酸 (Isopentenyldiphosphate, IDP)和二甲基丙烯焦磷酸酯(Dimethylallyl diphosphate, DMADP)同分异构体通过两个独立的途径细胞质中的甲羟戊酸途径(The cytosolic mevalonic acid, MVA)和质体中的甲基赤藓糖醇磷酸途径(Methylerythritol phosphate, MEP) (Matusova et al., 2005; Bouw
11、meester et al., 2007)(图 1.2) 。 2005 年 Matusova 等确立了 (+)-strigol 事实上是类胡萝卜素生物合成途径 (Carotenoidbiosynthetic pathway)的产物 (Matusova et al., 2005)，植物质体中的 MEP 途径产生 IDP 和 DMADP 来合成 SLs 的前体类胡萝卜素(Carotenoids)，以及其他化合物如单萜(Monoterpenes)，二萜(Diterpenes)，赤霉素(Gibberellin, GA) ，脱落酸 (Abscisic acid, ABA)以及叶绿素(Chlorophyl
12、ls) 的侧链，质体醌(Plastoquinones) 和叶绿醌(Phylloquinones)，而细胞质的 MVA 途径则产生倍半萜烯(Sesquiterpenes)，固醇类(Sterols)和三萜(Triterpenes)的前体(Humphrey et al., 2006)，其中 IDP 等前体能在两种途径中相互转换(Laule et al., 2003) (图 1.2)。第二章独脚金内酯合成途径 OsCCD7 的克隆与表达分析水稻分蘖是决定粮食产量最重要的农艺性状之一，也是决定株型结构的重要因素。水稻分蘖又是一种特殊的产穗分枝，研究控制水稻分蘖的分子遗传机理具有重要的理论意义和应用价值。
13、丛矮 2 号是标准的矮化多分蘖籼稻品种，据中华人民共和国国家标准植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南-水稻( 标准编号:GB 19557.7-2004)中介绍，该品种具有以下表型：茎秆较细，茎秆茎数(指单株成穗茎数) 极多，剑叶叶片长度极端，二次枝梗少，每穗粒数极少。本研究中我们采用图位克隆的方法克隆出导致丛矮 2 号矮化多分蘖的基因 OsCCD7/D17 并对其表达模式进行了初步分析。2.1 材料与方法2.1.1 水稻材料与农艺性状籼稻品种丛矮 2 号(cl2)、93-11 和 Dular，粳稻品种日本晴和 IC-2-1 由山东省水稻研究所袁守江提供，籼稻 Indica9 由本实验室保存
14、。矮化多分蘖突变体 S1-40 是由日本晴经 1% 甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate, EMS)诱变而来。2009 年在山东济宁分别播种 9311、cl2 、日本晴和 S1-40，成熟期统计株高、分蘖数目、节间长度、穗型及籽粒大小等主要农艺性状。第三章 独脚金内酯合成途径 OsCCD8 的克隆. 42-49 3.1 材料和方法. 423.1.1 水稻材料. 423.1.2 遗传群体的构建 .423.1.3 基因定位及候选基因的测序. 423.1.4 独脚金内酯处理及实时定量. PCR 423.2 结果与分析. 42-483.3 讨论 .48-49第四章 独脚金内酯信号
15、途径 D3 基因.49-674.1 材料与方法 .49-564.1.1 植物材料及杂交群体的构建. 494.1.2 菌株与载. 494.1.3 工具酶 .494.1.4 常规试剂及试剂盒. 49-504.1.5 gsor300097 突变位点的确定. 504.2 结果与分析. 56-654.3 讨论 .65-67第五章 独脚金内酯信号途径新基因.67-865.1.1 植物材料 .675.1.2 菌株与载体. 675.1.3 工具酶. 675.1.4 常规试剂及试剂盒. 67-685.2 结果与分析. 75-845.3 讨论. 84-86结论通过本论文的研究工作，得到如下结论：1. 水稻 DUS 测试标准品种之一籼稻品种丛矮 2 号(cl2) 具有典型的矮化多分蘖特征，遗传分析表明该性状是由一对隐性核基因控制的，并将突变基因定位在第 4 染色体长臂 InDel 标记 C4-CL5 和 C4-CL4 之间；测序发现 cl2 中的 D17/HTD1/OsCCD7 基因编码区第 1796 个碱基由 C 突变为 T，从而导致第 599 位的氨基酸由脯氨酸变成亮氨酸；利用 SLs 的人工合成类似物 GR24 处理 cl2，其多分蘖表型得到抑制。系统进
