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1、1大蒜素对人结肠癌 HT29 细胞增殖影响及作用机制研究作者：王旭平赵玲王容 郭锋 辛华【摘要 】 目的：探讨大蒜素对体外培养结肠癌 HT29 细胞增殖的影响，并探讨其作用机制。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定不同浓度大蒜素对 HT29 细胞增殖抑制率；流式细胞术测定细胞周期变化及凋亡相关蛋白 Bcl-2 与 Bax 的表达。结果：MTT 显示大蒜素能抑制人结肠癌 HT29 细胞的增殖，并具有时间-剂量依赖性；流式细胞术测定结果显示 10 g/ml 大蒜素可明显诱导 HT29 细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在 G2/M 期；可降低癌基因蛋白 Bcl 表达，而促进 Bax 表达。结论：大蒜素
2、对人结肠癌 HT29细胞增殖具有抑制作用，可能与细胞周期阻滞和凋亡相关蛋白表达有关。 【关键词】 大蒜素结肠癌细胞系 T29凋亡流式细胞术【ABSTRACT】 Objective: To study the affection of Diallyl trisulfide on cultured human colon carcinoma cell line HT-29 and its mechanism. Methods: The viability of cells after 2various treatments were determined using the method of M
3、TT. Flow cytometry were used to analyze the change of cell cycle and Bcl-2, Bax levels. Results: The proliferation of human colon carcinoma HT-29 cells were inhibited by Diallyl trisulfide. The inhibition was associated with dose and time dependence. Flow cytometry results showed that: 1） When cells
4、 were treated with Diallyl trisulfide at the concentration of 10 g/mL for 12 h and 24 h, the percentage of G0/G1 phase cells was decreased and that of G2/M phase cells was significantly increased compared with those in the control group.2） Diallyl trisulfide down regulated Bcl expression, while up-r
5、egulated bax expression. Conclusions: It was suggested that Diallyl trisulfide inhibited HT29 cell proliferation. And these were associated with arrest of cell cycles and down regulation of Bcl2/Bax ratio.【KEY WORDS】 Diallyl trisulfideHuman colon carcinoma cell line HT-29ApoptosisFlow cytometry大蒜素是一
6、种从大蒜鳞茎中分离出的具有多种生物学活性的化合物，其化学名为二烯丙基三硫化物。现代医学研究证实大蒜素具有抗菌、消炎、提高机体免疫力和抗肿瘤的作用1-3 。体外研究显3示, 大蒜素可以通过诱导癌细胞（如胃癌、前列腺癌）生成活性氧（ROS ） ，上调 Bax， Bak 和激活 Caspase 3 等方式促进其凋亡1，4，5 ，但大蒜素对结肠癌作用的研究较少。本研究以体外培养的结肠癌 HT29 细胞为材料，探讨大蒜素对结肠癌细胞增殖的影响并探讨其机制，以期为结肠癌的防治提供实验依据。1材料与方法1.1材料人结肠癌 HT29 细胞由山东大学医学院细胞生物学研究所提供；大蒜素（二烯丙基代磺酸酯）为上海禾
7、丰制药有限公司生产；MTT 、二甲基亚砜（DMSO） 、Ho33342、碘化丙啶（PI）为美国 Sigma 产品；DMEM、新生牛血清为美国 Gibco 产品；Bcl-2、Bax 单克隆抗体购自美国 BD 公司。1.2方法1.2.1细胞培养人结肠癌 HT29 细胞用含 10%小牛血清的DMEM 培养液，于 37 、5%CO2 饱和湿度条件下静置培养。选择对数生长期细胞进行分组实验。1.2.2MTT 法检测大蒜素对细胞增殖的影响细胞以 5104 ml-1 的密度接种于 96 孔培养板中，培养 48 h 后，每孔加入不同4浓度的大蒜素各 100 l ,终浓度分别为 1、 5、10、20 g/ml，
8、对照组加入含 10%FBS 的培养基，分别培养 12、24、48 h 后，分别向每孔加入 20 l MTT（5 mg/ml）溶液，继续培养 4 h，弃培养液，每孔加入 DMSO 100 l，脱色摇床振荡 5 min；酶标仪检测（吸光度为 570 nm） 。每时间浓度组设 3 个复孔,实验重复 3 次。所得 OD 值根据公式计算细胞抑制率。细胞抑制率（% ）= （1-OD实验组/OD 正常组）100% ，以空白组 OD 值调零。1.2.3大蒜素诱导结肠癌 HT29 细胞凋亡最适浓度筛选 以上各实验组加入大蒜素作用 24 h，加入 Ho33342（终浓度 10 g/ml）37 温育 20 min，
9、再加入 PI（终浓度 50 g/ml） ，荧光显微镜观察并记录图象。1.2.4细胞形态学观察10 g/ml 大蒜素分别作用 024 h，每隔 2 h 倒置相差显微镜观察一次，随机选取视野记录图象。1.2.5流式细胞仪检测大蒜素对细胞周期的影响 细胞以5104ml-1 接种于 25 cm2 培养瓶中, 培养 48 h 后，加入 10 g/ml 大蒜素，分别培养 12、24 h，弃培养液，加入 0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min 离心 8 min 收集细胞。细胞用 PBS 清洗 3次后，500 l PBS 悬浮细胞，加入含 10 g/ml 的 RNase 的PI，4 染色 30 min。
10、经 200 目滤网过滤后，上机检测。实验结果5采用 Modifit 软件进行细胞周期各期的百分率及亚二倍体的百分率分析。实验重复 3 次。1.2.6流式细胞仪检测大蒜素对 Bcl-2 和 Bax 的影响细胞以5104 ml-1 接种于 25 cm2 培养瓶中, 培养 48 h 后，加入 10 g/ml 大蒜素分别培养 12 和 24 h，收集细胞，以 PBS 清洗 3 次，70%乙醇 4固定 1 h。经 PBS 再次清洗后，不同时间组细胞分别加入兔抗人 Bcl-2 或兔抗人 Bax 一抗，37孵育 1 h，PBS 清洗后加入 FITC 标记山羊抗兔二抗，37 避光孵育 20 min。阴性对照以
11、PBS 代替一抗。PBS 洗 3 次后上流式细胞仪检测，实验重复 3 次。1.3统计学处理经 SPSS11.0 软件分析，组间比较采用方差分析，结果以 xs 表示， =0.05 为显著性检验标准。2结果2.1大蒜素对结肠癌 HT29 细胞活性的影响MTT 结果显示110 g/ml 大蒜素均能抑制 HT29 细胞的增殖，呈时间 -剂量依赖性；20 g/ml 大蒜素细胞毒性作用明显，作用 12 h，细胞抑制率为 74.73%，作用 24 h 以后细胞几乎全部死亡（表 1） 。2.2大蒜素诱导结肠癌 HT29 细胞凋亡最适浓度的筛选Ho33342 和 PI 染色结果（图 1）提示，各浓度组中，10
12、g/ml 大6蒜素对 HT29 细胞诱导凋亡作用最明显； 20 g/ml 大蒜素主要表现为细胞毒性作用。因此，本实验选取 10 g/ml 作为最适诱导浓度来探讨其作用机制。2.3细胞形态学观察正常条件下 HT29 细胞呈梭形或多角形，传代培养 48 h，细胞贴壁生长，有聚团现象；10 g/ml 大蒜素作用 6 h，细胞开始出现形态学改变，紧贴瓶壁的细胞边界模糊，部分细胞缩起，分裂相减少；大蒜素作用 12 h 开始有凋亡小体出现；大蒜素作用 24 h，大部分细胞回缩变圆，凋亡小体明显，部分细胞悬浮于培养基中，细胞碎片增多（图 2） 。2.4大蒜素对细胞周期影响流式细胞仪检测结果显示， 10 g/
13、ml 大蒜素作用 12 h，HT29 细胞凋亡率为 16.72%；作用 24 h细胞凋亡率为 24.05%。细胞周期均发生了明显的变化，主要表现为 G0/G1 期细胞减少，G2/M 期细胞增加，而 S 期细胞无明显变化（图 3） 。2.5流式细胞仪检测 Bcl-2 和 Bax 表达结果显示 10 g/ml大蒜素作用 12 和 24 h，可降低癌基因蛋白 Bcl-2 表达，而促进Bax 表达(表 2)。3讨论7近年国内外流行病学调查发现,大蒜素对多种肿瘤有一定抑制作用6,但具体机制尚未完全明确。本研究采用的大蒜素主要含三硫二丙烯,选择人结肠癌 HT29 细胞进行抑制增殖和诱导凋亡的研究，并初步探
14、讨了其可能的作用机制。细胞周期在肿瘤细胞的生长调控中具有重要作用 ,通过改变细胞周期来阻止肿瘤细胞的增殖已受到人们的关注7。本研究发现，大蒜素作用后 G1 期 HT29 细胞明显减少， G2/M 期相对增多。其原因可能是大蒜素抑制 G2/M 期, 使多数细胞不能通过 M 期向 G1期的转变，导致 G1 期细胞减少, 使大量细胞停留在 M 期,无法完成正常的有丝分裂，提示大蒜素对 HT29 细胞有周期特异性抑制作用；大蒜素对 HT29 细胞 M 期的阻滞作用，对临床应用大蒜素防治结肠癌, 尤其与周期特异性化疗药物辅助应用治疗结肠癌具有重要的理论意义。Bcl-2 家族在细胞凋亡中起着重要的作用，其
15、家族成员包括抑制凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-xl 等，促凋亡蛋白 Bax、Bbad 等。Bcl-2和 Bax 分别可以同源二聚体形式存在，二者之间也可以形成异源二聚体。Bax 的表达增多时，Bax-Bax 的同源二聚体便诱导细胞凋亡；而 Bcl-2 的表达增多时，Bax 便和 Bcl-2 形成更为稳定的异源二聚体来抑制细胞凋亡。Bcl-2/Bax 的比率可以调节细胞凋亡的速率88。本实验证明经大蒜素处理的 HT29 细胞， Bax 表达升高而 Bcl-2 水平明显降低。提示大蒜素可能通过降低 Bcl-2/Bax 的比率诱导HT29 细胞凋亡。【参考文献】1 Xiao D, Lew KL, K
16、im YA, et al. Diallyl trisulfide suppresses growth of PC-3 human prostate cancer xenograft in vivo in association with Bax and Bak inductionJ. Clin Cancer Res, 2006,12（22）:6836-6843.2 Li N, Guo R, Li W, et al. A proteomic investigation into a human gastric cancer cell line BGC823 treated with diallyl trisulfideJ. Carcinogenesis, 2006 , 27（6 ）:1222-1231.3 Zhou Z,
