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1、1人杀菌渗透增强性蛋白 N 末端片段在大肠杆菌中的表达作者：董伟，董晓慧，楚雍烈，杨娥，胡刚，郑建武 【关键词】 基因表达摘要：目的 构建表达人杀菌渗透增强性蛋白(BPI) N 端 193 个氨基酸的重组表达质粒，诱导表达 BPI193 重组蛋白。方法 应用RTPCR 的方法从 HL60 细胞内扩增出 BPI 氨基端 1-193 个氨基酸的基因序列，克隆入 T 载体。将 BPI193 基因片段定向克隆入原核表达载体 PET28a 中，构建重组的原核表达质粒 PETBPI193，转化大肠杆菌 BL21 菌株，用 IPTG 诱导表达蛋白。应用 SDSPAGE 检测蛋白表达情况，计算机薄层扫描分析蛋
2、白占菌体总蛋白百分比；Westernblot 技术检测表达蛋白的特异性。结果 从 HL60 细胞中扩增得到 579bp 的 BPI193 基因片段，构建了 TBPI193 亚克隆和PETBPI193 重组表达质粒。转化大肠杆菌 BL21，通过 IPTG 诱导，经 SDSPAGE 检测表明，成功表达了 6HisBPI193 融合蛋白。计算机薄层扫描分析表达量占菌体总蛋白的 12%。Westernblot 检测显示表达产物具有特异性。结论 成功构建了 PETBPI193 重组表达质粒。在大肠杆菌 BL21 内，诱导获得了 BPI193 与组氨酸融合表达的重组蛋白。2关键词：杀菌/渗透增强性蛋白；基
3、因表达；大肠杆菌Expression of human bactericidal/permeability increasing proteinNterminal fragment in E.coliABSTRACT: Objective To construct a prokaryotic expression plasmid of cDNA sequence encoding first 193 amino acids of BPI Nterminal and to express it in E.coli BL21. Methods Total RNA was extracted fro
4、m HL60 cell and then was amplified by using RTPCR. The PCR product was cloned into pMD18T vector. BPI193 gene was directly cloned into PET28a plasmid on the role of T4 DNA ligase. PETBPI193 recombinant expression vector was transformed into competent E.coli BL21 and protein expression was induced by
5、 IPTG. Fusion protein was detected by SDSPAGE and Westernblot. Results A 579bp DNA amplicon was amplified by RTPCR. TBPI193 subclone and PETBPI193 recombinant expression plasmid was constructed successfully. 6HisBPI193 fusion protein containing 193 amino acids of BPI Nterminal was expressed by IPTG
6、induced method. Fusion protein was detected by SDSPAGE and confirmed by Westernblot. The 3expressed fusion protein constituted 12% of total bacterial protein. Conclusion PETBPI193 recombinant expression plasmid was constructed successfully. To transform PETBPI193 recombinant plasmid into E.coli BL21
7、 and 6HisBPI193 fusion protein was expressed by IPTG induced manner.KEY WORDS: bactericidal/permeability increasing protein; gene expression; E.coli迄今为止，对脂多糖引起的并发症，如内毒素血症与败血症休克仍没有有效的治疗手段，临床治疗急需新的抗革兰阴性(G-)菌感染的药物。人杀菌渗透增强性蛋白(bactericidal/permeability increasing protein ，BPI) 是对细菌高度稳定的非催化蛋白，主要存在于人及哺乳动物多
8、形核白细胞(PMN)的嗜天青颗粒中,也可微量表达于 PMN 和单核细胞表面13。最新研究表明，BPI 还可表达于嗜酸性粒细胞和上皮细胞45，它不仅具有特异性杀伤 G-菌的作用，还可以中和内毒素，是一种具有广阔应用前景的“新型抗生素”6。在本实验中，我们建立了稳定表达 BPI 氨基端(BPI193)的原核表达系统，获得了高产量的纯化蛋白，为进一步研究 BPI 在体内外的生物活性，研发新的 BPI 产品创造条件。41 材料与方法1.1 细胞株、菌种和质粒 HL60 细胞株由第四军医大学微生物教研室雷迎峰博士惠赠；E.coli DH5 和 E.coli BL21 为本室保存菌株；pMD18T 载体为
9、 Takara 公司产品；PET28a 原核表达质粒为 Novagen 公司产品。1.2 主要试剂 Trizol 为 Invitrogen 公司产品；cDNA 第一链合成逆转录试剂盒购自 Fermentas 公司；Xho、BamH限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶、T4DNA 连接酶均为 Takara 公司产品；DEPC 为 Sigma 公司产品；DNTPs 购自北京鼎国生物公司；小剂量质粒提取试剂盒和 DL2000 DNA marker 购自北京天为时代公司，小分子量蛋白 marker 购自华美公司；溃疡性结肠炎患者血清由西安交通大学医学院第二附属医院检验科李步荣医师惠赠；山羊抗人 HRPI
10、gG 购自博士德生物公司；1640 培养基购自 Gibco 公司；DNA 凝胶回收试剂盒为北京赛百盛公司产品。1.3 引物的设计与合成 根据 GenBank 数据库已收录的 BPI cDNA 的基因序列，借助于软件 Primer Premier 5.0 和 DNA club设计了扩增 BPI 1193 个氨基酸的上下游扩增引物。P1 5 CTGGATCCATGGTCAACCCTGGCGTCGT 53(BamH)P2 5 CCGCTCGAGTTACAGAGTCTGGAAATAAGG 3(Xho)在引物的 5端分别添加了 BamH和 Xho两个酶切位点，以确保酶切后可以插入 PET28a 原核表达
11、载体中，并且读码框正确，还添加了起始密码 ATG 和终止子 TAA。扩增的 BPI 位于 124-702bp，DNA 长度为 579bp。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。1.4 方法1.4.1 RTPCR 扩增目的基因 用 Trizol 试剂从 HL60 细胞中提取总 RNA，按试剂盒说明反转录出 cDNA 第一链，然后进行 PCR扩增目的基因。经 15g/L 的琼脂糖凝胶电泳分析结果后，用凝胶回收试剂盒回收 PCR 产物。通过 10g/L 的琼脂糖凝胶电泳观察回收情况并目测定量。1.4.2 PCR 产物与 T 载体的连接及鉴定 按照 pMD18T 载体说明书， 进行 PCR 回收
12、产物和 pMD18T 载体的连接反应。将连接产物转化感受态 E.coli DH5，经抗生素和蓝白斑筛选出阳性菌落，6然后用 PCR、限制性内切酶分析和 DNA 测序证实 BPI193 是否插入 T 载体以及基因序列有无突变。1.4.3 PETBPI193 重组质粒的构建 分别用 BamH和Xho双酶切 TBPI193 和原核表达载体 PET28a，酶切产物经10g/L 琼脂糖凝胶电泳后，用北京赛百盛公司凝胶回收试剂盒回收，DNA 定量后在 T4DNA 连接酶的作用下将 BPI193 定向克隆入原核表达载体 PET28a 中，构建重组的原核表达质粒 PETBPI193。转化大肠杆菌 BL21 菌
13、株，筛选出阳性菌落，并采用 PCR 和限制性酶切技术鉴定，得到表达菌。1.4.4 目的蛋白的诱导表达和鉴定 用 IPTG 诱导表达菌，采用不同的 IPTG 诱导浓度(1、2 、3、4mmol/L)和诱导时间(1、2、3、4、5、6h)，应用 SDSPAGE 技术检测细菌蛋白表达情况，获得最佳表达条件，计算机薄层扫描分析表达目的蛋白占菌体总蛋白百分比。应用 WesternBlot 技术检测表达蛋白的特异性。2 结果2.1 RTPCR 扩增结果 RTPCR 反应后取 5L 经 15g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增出约 602bp 的基因片段，与预期大小相符。72.2 BPI193 基因片段与
14、T 载体的连接 将获得的 BPI193 基因片段 RTPCR 的产物凝胶回收后，按照 pMD18T 载体说明书操作，双酶切结果切出约 585bp 和 2690bp 左右的基因片段，与预期相符(图 1)。送上海华诺公司测序，证明 BPI193 基因序列完全正确，命名为 TBPI193。图 1 重组质粒 TBPI193 的 PCR、双酶切鉴定（略）Fig.1 Identification of plasmid TBPI193 by PCR and restriction enzyme digestion1: DL2000 DNA marker; 2: BPI193 from PCR; 3: res
15、triction enzyme digestion with BamH and Xho2.3 PETBPI193 重组质粒的构建 用 BamH和 Xho 分别双酶切 TBPI193 和 PET28a 质粒，凝胶回收试剂盒回收得到纯化产物。用 T4 连接酶连接，转化 E.coli DH5，卡那霉素筛选细菌，并进行 PCR 和 BamHXho双酶切鉴定，PCR 扩增出约 602bp的基因片段，双酶切获得约 585bp 和 5329bp 的基因片段，与预期相符(图 2)。8图 2 PETBPI193 重组质粒的 PCR、酶切鉴定（略）Fig.2 Identification of recombina
16、nt plasmid PETBPI193 by PCR and restriction enzyme digestion1: DL2000DNA marker; 2: PCR product of TBPI193; 3:PCR product of PETBPI193; 4: double restriction enzyme digestion with BamH and Xho2.4 BPI193 重组蛋白的表达和鉴定 用 IPTG 诱导表达菌BL21，发现随时间延长蛋白量有所增加，在 4h 时表达量较大。在不同 IPTG 浓度的条件下诱导蛋白表达， 2-3mmol/L 时蛋白表达量比较丰富。诱导后在 21ku 左右处有蛋白表达，该蛋白大小与预期相符。经薄层扫描分析，表达蛋白量占菌体总量的 12%左右。可溶性分析表明表达的 BPI193 重组蛋白以包涵体的形式释放(图 3)。Westernblot 鉴定，结果表明用 IPTG 诱导后的 P
