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1、1中枢神经损伤再生修复去抑制作用的研究【摘要】 中枢神经损伤后，由于其所处微环境存在多种轴突生长抑制因子，它们主要通过细胞膜上一个复合受体将抑制信息传递至细胞内，导致生长锥塌陷，轴突生长受到抑制。据此，人们设计了各种方法去除轴突再生时的抑制作用。本文简要的介绍了这些研究。 【关键词】 中枢神经系统损伤再生去抑制作用Research development on disinhibition of the regeneration after CNS injuryAbstract Axons in the adult central nervous system（CNS）are unable to
2、 regenerate after injury due to the growth-inhibitory proteins present in CNS myelin. Inhibitors signal through a common receptor complex in neurons caused collapse of the growth cone and prevent axon growth. Based on these, there are plenty of researches on disinhibition of axon regeneration. This
3、review focused on these researches.2 KEYWORDS: CNS；injury；regeneration；disinhibition0 引言目前研究表明，中枢神经系统髓磷脂（CNS myelin）中存在大量的轴突生长抑制因子如 MAG1-3、OMgp4、CSPG5、Nogo6-8（包括 Nogo-A，Nogo-B，Nogo-C 三种蛋白，其中Nogo-A 抑制神经再生的作用最强9,10）造成了成年哺乳动物中枢神经损伤后再生困难。它们主要是通过神经元上一个由NgR11,12、 p75NTR13和 LINGO-114组成的复合受体1,4,11,14,15将抑制信
4、号传入细胞内，激活 Ras 家族RhoA16,17，通过 ROCK/LIM 激酶18 引起肌动蛋白解聚导致生长锥塌陷11,12,14，起到抑制轴突再生的作用。这些研究结果对去除中枢神经损伤后再生修复抑制作用提供了基础。去抑制作用的研究目前主要有以下几种方式：引入特异性物质16,19，对神经元细胞内传导的抑制信号进行阻断；使用抗体20,21，封闭抑制蛋白；借助基因敲出11,22，制作抑制因子缺失突变体，或改变抑制因子受体，关闭其产生生物效应；在细胞内形成特异的 siRNA（small interference RNA） ，对受体蛋白、信号蛋白的形成进行 RNA 干扰（RNAi）23,24。从而使
5、去除中枢神经损伤后再生修复过程中抑制作用成为可能。31 引入特异性物质阻断抑制信号传导抑制信息经受体传入神经元细胞后将 RhoA 激活，再由活化的RhoA 与下游 ROCK 结合，取代 ROCK 末端自我抑制区，激活其催化区，使其活化，并进一步使肌球蛋白和肌球蛋白磷酸酶磷酸化，抑制肌球蛋白磷酸酶活性，活化肌球蛋白，促使应力纤维形成，调节肌动肌球蛋白的收缩力，对肌动肌球蛋白系统造成影响，导致生长锥塌陷，轴突再生受到抑制18。RhoA 是细胞内传导抑制信号、参与信号级联放大过程中及调控细胞支架动力学的关键物质25-27。对其进行封闭，可有效阻断再生修复过程中的抑制作用。有研究表明，从肉毒杆菌中提取
6、的 C3酶，可对 RhoA 的效应结构域进行 ADP 核糖基化作用，从而抑制其与信号传导下游的效应物发生相互作用，阻断信号的传导28,29。经 C3 酶处理后的初级视网膜神经元，即使是位于髓磷脂相关糖蛋白和髓磷脂底物上其轴突仍然可生长延长16。应力纤维的形成是由 Ca2+所调控的，Ca2+ 的调控信息则通过ROCK（Rho 相关丝氨酸/苏氨酸激酶）介导，嘧啶衍生物 Y-27632可阻断 ROCK 对 Ca2+调控信息的感受，阻止应力纤维形成，避免影响肌动肌球蛋白系统，生长锥正常生长，轴突再生19,30-32。42 抗体封闭抑制蛋白Schwab 等33研究发现单克隆抗体 IN-1 能够识别中枢神
7、经系统髓磷脂中大小为 250/30kDa 可对轴突生长有抑制作用的糖蛋白。使用 IN-1 封闭此糖蛋白后，可促进轴突再生20,34,35，但是再生轴突的数量比较少，因为在中枢神经系统髓磷脂中还存在其他的抑制蛋白2,36,37。Huang 等21认识到，如想更好的促进中枢神经的轴突再生，必须将这些抑制蛋白一起封闭，并设计了一种可以同时封闭多种抑制蛋白的方法。他们将富含髓磷脂和一些抑制糖蛋白的小鼠脊髓制成匀浆后对成年雌性 BALB/c 小鼠（810 周龄）每周两次进行免疫，3wk 后在 T9（胸 9）水平将脊髓对半切开，使双侧的皮质脊髓束均受损。再继续每周两次免疫 3wk 后，他们观察到轴突生长的
8、最长长度在不同的小鼠间为 511mm 不等，但大部分都达到了6mm，一小部分为 11mm。通过使用富含髓磷脂和一些抑制糖蛋白的小鼠脊髓匀浆对成年小鼠自身免疫系统进行刺激，从而产生可针对多种抑制因子作用的多克隆抗体，在损伤后使脊髓轴突再生增强。3 基因敲出5通过基因敲出，可去掉特定基因编码的特定蛋白，从而关闭该蛋白所产生的生物效应。研究证实，关闭了抑制效应的抑制蛋白、受体蛋白缺失突变体，其中枢神经元轴突可有效再生。Simonen 等22使用 PGK-neo 基因将 nogo 基因的 2 个外显子和 1 个内含子替换掉，制作出仅 Nogo-A 缺失的基因敲出小鼠6,38，并观察到将其胸部脊髓对半切
9、开 2wk 后，Nogo-A 基因敲出小鼠与同类野生型小鼠相比，在受伤部位，有更多的皮质脊髓束纤维长出，而未受损的皮质脊髓束纤维也大量发芽。将 nogo 基因中特异编码 Nogo-A/B 的外显子直至其下游的ATG 始端的整个基因组片断删除，制作出 Nogo-A/B 缺失突变小鼠，通过对轴突长度的测量，Zheng 等39发现，用 Nogo-A/B 缺失突变小鼠的髓磷脂做底物比用同种野生型小鼠的髓磷脂做底物对取材于出生后 7d 小鼠的小脑神经元轴突生长的抑制程度，降低了1/4。Yamashita 等40,41证实 p75NTR 跨膜蛋白是将神经元细胞外的信息传给细胞内 Rho 的信号传导要素，当
10、细胞外的抑制因子结合到由 NgR, p75NTR 和 LINGO-1 组成的复合受体1.4.11.14.15时，p75NTR 细胞内的结构域作用于 RhoA41，从而实现抑制信号由6细胞外进入细胞内。将 p75 敲出的突变小鼠与同种野生型小鼠相比，其脊髓背根神经节细胞（dorsal root ganglion neurons， DRGN）可明显克服髓磷脂的生长抑制作用11。4 RNA 干扰（RNAi）小片段的 siRNA 能够非常特异性地引起与之序列相应的单个内源性基因 mRNA 的降解，产生高效的转录后水平基因沉默，形成该基因表型的缺失突变体，消除了该基因表型的生物学效应。且由于siRNA
11、有非常高的特异性，极小的量即能获得高效的中枢神经轴突再生去抑制作用42 。Higuchi 等23合成了 23nt 大小，在 3羟基末端有两个不配对且靶向于小鼠 p75NTR 编码区 5端内侧部的核苷酸，特定的 p75-siRNA，通过阳离子转染剂转染到细胞内后，他们发现浓度为2mg/L 的 p75-siRNA 已将 p75NTR 蛋白的表达封闭，虽然不能改变 DRGN 原有水平的轴突生长状况，但可以完全阻断 MAG 对轴突再生的抑制作用。根据 Elbashir 等43的设计原理，Ahmed 等24分别合成了p75NTR-siRNA、NgR-siRNA 和 RhoA-siRNA。分别将它们进行转
12、染。结果，由于 p75NTR-siRNA 的存在，DRGN 内 p75NTR 的7免疫反应性极其显著的降低，再向其中加入中枢神经系统髓磷脂和FGF2（成纤维细胞生长因子 2） ，神经节细胞轴突再生增强；同样将 NgR-siRNA 转染 DRGN，NgR 的免疫反应性也大大降低，中枢神经系统髓磷脂和 FGF2 同时存在的情况下，神经节细胞轴突 -tubulin+（微管蛋白）生长增强；转染了 RhoA-siRNA 的DRGN，完全封闭了 RhoA 蛋白，包括 Rho-GTP 的表达，使神经节细胞轴突 -tubulin+生长不受 RhoA 调节信号的干扰，轴突生长能力增强。5 结语中枢神经系统对人类
13、的重要性不言而喻，为了去除中枢神经损伤再生修复的抑制作用，促进损伤后的中枢神经有效再生44,45，人们设计了很多种实验方法来去除这种作用，特别是在分子水平、基因水平进行了大量的研究，除了文中所涉及的一些方法外，有研究证实利用反义寡核苷酸技术也能减弱中枢神经再生的抑制作用46。这些成果使人类看到了中枢神经损伤后再生修复的美好前景。但这些去抑制作用的方法，仍存在一定的局限性。如 Nogo-A 抑制蛋白至少同时拥有两个独立的抑制作用结构域，与 Nogo-B,Nogo-C 相同的羧基端 Nogo-66 区域7,38,47和被称为 NiG 的独立中央区抑制结构域4,6，虽然可借助基因工程造成神经元细胞
14、p75NTR 缺失，将 Nogo-66 的抑制信息关闭在神经元细胞外，但不通过 p75NTR8向细胞内传递抑制信息的 NiG 仍可继续发挥抑制神经元轴突再生的作用48。 NiG 抑制神经元轴突再生主要是通过激活神经元细胞内Rho-A 和抑制 Rac1，即便是用 RhoA-siRNA 将表达 Rho-A 的基因沉默24 ，也只能去除 NiG 部分抑制作用，且关闭了 Rho-A 激活途径后，Rac1 抑制途径作用是否会因此而增强？此外，在中枢神经系统是否还存在尚未发现的轴突再生修复抑制因子、相应的受体蛋白，以及细胞内的信号传导途径？若要进一步探索去除中枢神经损伤再生修复抑制作用的课题，这些问题仍待
15、研究。【参考文献】1 Liu BP, Fournier A, GrandPre T, Strittmatter SM. Myelin associated glycoprotein as a functional ligand for the Nogo-66 receptor. Science ,2002;297:1190-11932 McKerracher L, David S, Jackson DL, Kottis V, Dunn RJ, Braun PE. Identification of myelin-associated glycoprotein as a major myelin
16、-derived inhibitor of neurite growth. Neuron ,1994;13:805-8113 Mukhopadhyay G, Doherty P, Walsh FS, Crocker PR, Filbin MT. A novel role for myelin-associated glycoprotein as an inhibitor of axonal regeneration. Neuron ,1994;13:757-76794 Wang KC, Koprivica V, Kim JA, Sivasankaran R, Guo Y, Neve RL, He Z. Oligodendrocyte-myelin glycoprotein is a Nogo re
