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1、 单分子定位显微成像系统 使用手册 生物科学与技术学院 植物细胞生物学创新团队 编印 单分子定位显微成像系统 使用手册 生物科学与技术学院 细胞生物学创新团队 万迎朗 ,李晓娟 ,吕雪芹 ,崔亚宁 编印 注意事项： 单分子定位显微成像系统 使用必须遵守 本手册规定的操作步骤和操作规范。使用人员必须经过管理人员培训之后，才能获得独立操作权限。如果被发现 违背规范将被取消使用资格。 为保证设备 使用的正常秩序， 使用前需预约， 请到 cell_ 邮箱预约后使用 ，邮箱密码请询问培训老师 。 最早可提前两周预约实验，如无法如期开展实验，请至少提前 4 小时取消预约，以方便他人继续使用。 单分子定位显
2、微成像系统需避光，防尘。使用者必须换专用拖鞋或戴上鞋套才能进入。任何时候不得开启窗户。 使用 TIRFM 时请保持室内空调开启 ，保持恒温，除湿 。显微镜室设定温度为22-25 摄氏度 。 使用后请保持台面清洁。 制备样品时必须在专用的台面上进行，不允许在仪器的防震台上（或附近）制备样品 。 使用后规范登记。 如遇 故障或者 以下情况请联系李晓娟老师 （ 主楼 416, 或 电话 13501323181） 或万迎朗老师（ 62336409， 18612523332） ： 需要调整激光强度； 需要校正激光焦点； 操作时出现任何异常。 1、 硬件设备及 开机顺序 图：显微系统正面视图，第一层。 按
3、 以下 数字标注顺序开启系统。 1.1 长效汞灯开关 （非必选项） 。 * 该电源控制器置于系统支架上层； * 当实验需要荧光显微镜观测时，请首先打开此汞灯开关 （箭头） 。 * 如果不需要荧光观测，请保持关闭。 * 汞灯需预热与冷却，请勿频繁开关，影响寿命。 一旦汞灯开启， 30 min 后方可关闭。汞灯关闭后，也需间隔 30min 再次开启 。 1.2 显微镜 控制器开关 * 该控制器 置于系统支架上层； * 该控制器 是电脑控制软件与 显微系统 等联系的纽带，如遇到软件无法检测到仪器等情况，请注意是否已经打开 (箭头所示 )。 1.3 激光器 开关 * 开机请按左上方 银色圆形 按钮（箭
4、头）。 本显微系统配置四套固体激光器。 可通过物镜出口判断激光器是否正常工作。 * 右上角虚线所示区域放大如下： 此控制器中的红色按钮（箭头所示） 为激光器紧急关闭按钮。如遇危害健康的强光泄露情况，请用力按下以关闭激光。平时保持开的状态即可。 1.4 显微镜触屏控制面板 * 控制面板开关位于控制器右后方。 * 通过控制面板选择物镜，请不要在镜头处 手动 转 换 物镜。 本显微镜配置镜头包括： 10X， 20X， 40X， 60X， 100X。其中 60X 与 100X为油镜， 滴加镜油前先确定镜头选择正确 。 * FL：荧光显微观察； DIC：微分相差干涉显微观察，只适用于 20X物镜； BF
5、： 明场 显微观察。 请不要 选择 PO 或 RC。 * EPI：表面荧光观察 。 DIA：明场照明 * TIRF 观察时，请 在 Mirror 中 选择 1TIRFM-4CH。 * TIRF 观察所用载玻片不适用自动对焦， 勿随意调节 Focus 相关 按钮 。 1.5 EMCCD 相机 1 号 （标签编号 00） , EMCCD 相机 2 号（标签编号 01） 显微镜镜体左侧 显微镜镜体右侧 * 开关位于 EMCCD 后侧，为圆形银色按钮。 * EMCCD 上 切勿 溅入任何液体！ * 每个 EMCCD 的 具体功能 详见 3.3.1 节。 1.6 显微镜操作平台 * 注意轻柔操作，特别是
6、调节 粗准焦螺旋 时需要 注意物镜不能压迫样品，避免物理损伤 。 * 下方黑色按钮 1:切换至目镜观察； 2:目镜和 EMCCD 各分一半光信号； 3:切换至 EMCCD 采集信号。 1.7 电脑 * 操作软件的使用见下一章； * 只能使用 DVD/CD 刻录实验数据 ， 不能使用 U 盘 或者移动硬盘拷贝数据 。 1 3 2 2、 激光开关和管理 软件 （ Cohenrent connection） 双击图标，打开软件 如下 在此界面开启或关闭相应激光。 3、 成像软件 MetaMorph 的应用 3.1 双击 MetaMorph 应用程序 图标 双击图标后，开始界面如下图所示 在此界面进行
7、成像、图像处理等操作。 3.2 选择所需激光 或汞灯波长 BF: 明场 DIC： 微分干涉相差显微镜 FL： 荧光显微镜照明，需开启汞灯 CY5， DAPI， GFP， YFP：相应荧光染料 L： 激光，用于 TIRFM 观察 数值为激光波长 3.3 成像操作快捷键 ： * Set Acquisition Channel: 点击选择 EMCCD 相机 00 或 01 (见 3.3.1)； * Configure Illumination: 选择荧光强度和荧光通道 ，调节激光强度 (见 3.3.2)； * CellTIRF System: 调节 TIRFM 激光 入射角等(见 3.3.3)； *
8、 Aquire: 拍摄 参数调节 界面，可调节曝光时间和电子增益值等 (见 3.3.4)； * Multi Dimentional Acquisition:多通道成像 调节界面 (见 3.3.5)； * Review Multi Dimentional Data:查看所拍摄的影像 (见 3.3.6)； * Close All: 关闭对话框。 3.3.1 Set Acquisition Channel: * 本系统采用双 EMCCD 成像 ，可同时采集四色荧光 。 * 相机 01（见硬件设施一章），收集明场图像，也可 收集 405 和 488nm 激光 激发的荧光 信号； * 相机 00（见硬件
9、设施一章）， 收集 561 和 647nm 激光 激发的荧光 信号 。 3.3.2 选择荧光强度和荧光通道 Configure Illumination: * 在右侧列表栏双击选择所用激光后，通过拖拽左侧灰色方块或者直接输入数值调节激光强度， 点击 Close 键 关闭该界面，在跳出的对话框中点击 YES，此时激光即调节到所需强度。 * 请勿改变 Shutter 的状态 。 3.3.3 CellTIRF System: 调节 TIRF 入射角 * Wildfield：调整激光入射角到 0； * Critical Angle：调整激光入射角到 TIRFM 临界角 ； * 可通过调整 Positi
10、on 处的灰色方块微调入射角度。 3.3.4 Aquire: 拍摄参数调节界面 * Exposure Time: 曝光时间，根据实验目的和荧光信号的强弱调节； * Digitizer: 成像速度 ； * EM Gain: 电子增益，根据信噪比调节 ； * Use Active Region/ Full Chip： ROI 选择 或者全幅成像； * Show Live：实时观察； * Acquire：单帧成像。 3.3.5 Multi Dimentional Acquisition: 多通道成像拍摄界面 * Saving: 选择实验数据保存位置 ； * Timelapse: 拍摄时间序列图像时，
11、 调整 拍摄帧数； * Wavelength: 选择拍摄所需激光波长，两个波长条件下可以分别调节 EM Gain 和 Expose time； * : 实时观察； * Acquire: 多通道 /时间序列影像采集。 3.3.6 Review Multi Dimensional Data:查看拍摄的影像 3.4 保存文件 fileSave 或 Save As, 建议保存为 TIFF 格，以便后期计算。 4、 关机： 擦拭镜头 ： 若使用油镜，实验结束时，先用擦镜纸擦干镜油，再用沾有无水乙醇的擦镜纸，以由中心向外画圈的方式擦拭镜头。擦镜纸同一部位不得反复擦拭镜头，以免污物颗粒划伤镜头。若不慎将 镜 油 滴到其他镜头，请用相同方式处理。擦拭 完毕 ， 将物镜镜头降到最低处（关闭硬件后，将无法调整镜头位置） 。 关闭 显微镜控制器、激光器等 硬件，除 EMCCD 相机（ 00、 01） 最后关闭外，其它硬件关闭的顺序没有硬性要求 。 先关闭 MetaMorph 软件，等待 5min 以上 才能 关闭 EMCCD（ EMCCD 需由工作温度 -70 缓慢 升至室温 ） ！ 关闭 空调 。 检查所有部件是否关闭 ， 将 实验台面恢复整洁 。 登记使用记录本，如有问题及时通知负责老师。 锁门离开。
