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1、1survivin 和环氧化酶-2 在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其相关性作者：刘洁庄乾元，余沁楠，窦启锋，张英杰【摘要 】 目的 探讨膀胱移行细胞癌组织中凋亡抑制蛋白survivin 和环氧化酶 -2(cox-2)的表达与肿瘤生物学行为之间的关系及其二者的相关性。方法 应用免疫组化 Envision 法，检测 42 例膀胱移行细胞癌组织标本和 10 例非肿瘤正常膀胱组织 (正常对照组)中survivin 和 cox-2 的表达。结果 42 例膀胱移行细胞癌组织中survivin 和 cox-2 表达的阳性率分别为 78.6%和 81.0%，正常对照组中均未见表达；survivin 表达强度与
2、肿瘤分期及复发呈正相关关系(P0.05)；cox-2 表达强度与肿瘤分级和分期呈正相关关系(P0.05)；survivin 和 cox-2 在膀胱移行细胞癌中的表达密切相关(rs0.327,P0.05)。结论 Survivin 和 cox-2 在膀胱移行细胞癌组织中普遍表达，且表达密切相关，二者可能在膀胱癌的发生、发展过程中起重要作用，并与浸润关系密切。 【关键词】 膀胱癌；移行细胞；survivin；环氧化酶-2；免疫组2织化学survivin 是凋亡抑制蛋白(inhibitor apoptosis protein, IAP)家族的成员,是目前已知最强的抑制凋亡因子。主要通过抑制半胱天冬蛋白
3、酶 3(caspase-3)和半胱天冬蛋白酶 7(caspase-7)的活性而抑制细胞凋亡1 。环氧化酶 -2(cyclooxygenase-2, cox-2)为诱导酶,生理状态下多数细胞中不存在,只有在细胞受到炎症刺激、组织损伤或细胞恶性转化时表达增强，且与肿瘤的浸润、转移、细胞凋亡等特性有关。本文探讨 survivin 和 cox-2 在膀胱移行细胞癌中的表达和临床病理特征之间的关系及二者的相关性。1 材料与方法1.1 一般材料 收集新乡医学院第一附属医院 2002 年 3 月-2004年 8 月归档膀胱移行细胞癌手术切除石蜡标本 42 例，均经病理科资深医师核实。病理分级级 15 例，级
4、 17 例，级 10 例；临床分期 Tis-T1 期 15 例，T2-T4 期 27 例；男性 34 例，女性 8 例，年龄 35-93 岁，平均 62 岁；原发肿瘤 29 例，复发 13 例；术时肿瘤直径小于 3 cm 者 27 例，大于等于 3 cm 者 15 例；术时肿瘤部位(肿瘤多发者按相应部位计入) 左侧壁 19 例，右侧壁 17 例，顶壁10 例，膀胱底、颈及三角区 9 例；术时可视肿瘤单发者 28 例，多3发 14 例；临床病历资料均完整。另取 10 例膀胱部分切除之正常膀胱黏膜为正常对照。1.2 主要试剂 survivin 兔抗人多克隆抗体 (美国 Santa Cruz 公司)
5、；cox-2 鼠抗人单克隆抗体、通用型 Envision 试剂盒 PV-6000、显色剂 DAB 均购自北京中山生物技术有限公司。1.3 方法 采用免疫组化 Envision 法，严格按照 Envision 试剂盒所附说明书进行操作。一抗 cox-2 为工作液可直接滴加，survivin 稀释至 1100。切片常规脱蜡至水，3%(体积分数)H2O2室温封闭 10 min，微波抗原修复，10%(体积分数)羊血清室温孵育15 min，分别滴加 cox-2、survivin 一抗， Envision 试剂盒 A 液、B 液，DAB 显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，PBS 替代一抗作阴性对照。1.
6、4 结果判定标准 采用双人双盲随机阅片，对染色结果进行定性和半定量分析。survivin 染色阳性以胞核和胞浆内出现棕色颗粒，cox-2 染色阳性以细胞胞浆内出现棕色颗粒为准。判定方法2 ：在 400 倍光镜下至少观察 5 个视野，根据免疫组化染色强度及阳性细胞数量进行半定量评分，分别记 0-3 分，其中染色强度以多数细胞呈色反应为准。不着色为 0 分，浅棕黄色为 1 分，棕黄色为 2 分，深褐色为 3 分。阳性细胞数 10%记为 0 分， 10%-45%为 1 分，446%-65%为 2 分，65% 为 3 分。染色强度及阳性细胞数得分相乘，0 为阴性(-)，1-2 分为弱阳性(+)，3-4
7、 分为阳性() ，5-6 分为强阳性() 。1.5 统计学处理 组间率的差异用 2 检验，不满足 2 检验条件时用 Fishers 确切概率法；等级资料的相关性分析用 Spearman等级相关。检验水准均为 =0.05，使用 SPSS10.0 统计软件完成。2 结 果2.1 免疫组化染色结果 survivin 蛋白染色主要表达于癌细胞胞核内(图 1A)，高分级时可见核、浆共染甚至胞膜着色( 图 1B)，胞核内棕色颗粒呈均匀性分布或点片状浓集。cox-2 蛋白染色表达于癌细胞胞浆，部分以核周为著，胞浆内棕色颗粒可呈均匀性分布或团块状局部浓集，色度较深(图 1C、D)。正常对照组均未见染色。图 1
8、 各组 survivin 及 cox-2 的表达 (Envision200)A： G2 膀胱移行细胞癌中 survivin 的表达；B：G3 膀胱移行细胞癌中 survivin 的表达；C ：G2 膀胱移行细胞癌中 cox-2 的表达；D：G3 膀胱移行细胞癌中 cox-2 的表达52.2 survivin 和 cox-2 的表达与其他因素的关系 患者的性别、年龄、术时肿瘤的大小、数目及部位无关(P0.05)。2.3 survivin 和 cox-2 在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜中的表达 见表 1。2.4 survivin 和 cox-2 在膀胱移行细胞癌各分级中的表达 见表2。2.5 su
9、rvivin 和 cox-2 的表达与膀胱移行细胞癌临床病理分期的关系 见表 3。2.6 survivin 和 cox-2 在原发、复发膀胱移行细胞癌中的表达 见表 4。2.7 膀胱移行细胞癌中 survivin 和 cox-2 表达的相关性 见表5。表 1 survivin 和 cox-2 在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜中的表达表 2 survivin 和 cox-2 在膀胱移行细胞癌各分级中的表达表 3 survivin 和 cox-2 的表达与膀胱移行细胞癌临床病理分期的关系表4 survivin 和 cox-2 在原、复发膀胱移行细胞癌中的表达 表 5 膀胱移行细胞癌中 survivi
10、n 与 cox-2 表达的相关性3 讨 论6膀胱移行细胞癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，约占膀胱上皮性肿瘤的 90%以上，具有多源性和异质性两大特点。提高膀胱癌患者治疗效果和总体生存率的关键在于早期诊断，并根据其生物学特点采取合理有效的治疗并严密随访。由于 survivin 和 cox-2 在绝大多数人类恶性肿瘤中高表达，而在大多数正常组织中不表达或低表达，具有很好的敏感性和特异性，从而成为近年来肿瘤研究的热点。3.1 survivin 在膀胱移行细胞癌中的表达及意义 survivin 是目前已知的最强的凋亡抑制因子，除了在甲状腺和胎盘中有微量表达外，在成人正常组织中均无表达，survivin
11、mRNA 和蛋白几乎在所有的人类癌症中都有表达，而在癌旁正常组织和成人分化成熟组织中并不表达。文献报道，survivin 在不同肿瘤中的阳性表达率，由胃癌的 35%到恶性黑色素瘤的 93%不等，膀胱癌为 57.8%-78%3-4 ，本研究为 78.6%。目前，survivin 免疫组化染色的细胞定位仍存在争议5 。在不同的肿瘤组织中， survivin 可表达于胞浆、胞核甚至胞浆、胞核均表达，在同一种肿瘤组织内亦可出现胞浆或胞核为主的不同表达6 。有相关报道显示， survivin 的核表达往往提示较好的生存期和预后7-10 。本实验 survivin 的表达主要定位于胞核，仅在级膀胱移行细胞
12、癌中出现了核浆共染和胞膜着色的情况，但出现胞浆的染色与肿瘤恶性程度的增高和不良预后的关系，尚需进一步的实验证实。本实验显示，survivin 的表达程度与膀胱7移行细胞癌的临床分期和复发呈正相关，而与肿瘤的分级无关；提示 survivin 的表达水平随肿瘤浸润深度的增加和复发次数的增多而增高，是监测肿瘤浸润和复发的良好指标。在肿瘤细胞的不同恶性程度间其表达程度无明显差异，尚不能以其表达水平来判断肿瘤细胞的恶性程度。3.2 cox-2 在膀胱移行细胞癌中的表达及意义 cox 又称为前列腺素(PGs)内过氧化合成酶，是催化花生四烯酸转变为重要活性物质前列腺素的关键限速酶。哺乳动物的 cox 有两种
13、同工酶 cox-1 和 cox-2，cox-1 属于结构型基因，在正常组织和细胞中表达，参与维持机体正常的生理机能。cox-2 是一种诱导酶，一般只在诱导因子的作用下表达上调，这些诱导因子包括各种细胞因子、生长因子以及致癌物质等，在正常生理状态下多数组织内几乎检测不到。cox-2 可通过诱导肿瘤血管的生成、增强浸润和转移、促进增殖、抑制凋亡及抑制肿瘤免疫等机制促进肿瘤发生发展11 。本实验 cox-2 的表达率为 81%，与文献报道相同。半定量分析显示，cox-2 的表达程度与肿瘤的分级和分期呈正相关，而与肿瘤的复发关系不大。提示 cox-2 的表达水平随恶性程度和肿瘤浸润深度的增加而增高，是
14、评价肿瘤恶性程度和侵袭性的良好指标。其表达程度在原复发癌中无明显差异，提示以其表达程度判断肿瘤的复发倾向证据不足。3.3 膀胱移行细胞癌中 survivin 和 cox-2 表达的相关性及意义 8survivin 和 cox-2 在肿瘤发生发展中的重要作用，使得二者的关系成为近年来国内外学者探讨的热门课题。Dalwadi 等12 在对cox-2 的研究中发现了一个新的通路，即 cox-2 可通过诱导 IL-6 的表达激活 STAT3，而 STAT3 或 IL-6 的激活可抑制凋亡和增强survivin 的表达，从而导致 survivin 依赖的凋亡抑制和 VEGF 的产生而形成肿瘤。Krysa
15、n 等13-14的研究显示，survivin 与 cox-2 的表达呈正相关关系，二者在人类非小细胞肺癌中常表达上调和共同表达。采用 siRNA 抑制 survivin 的表达可降低过度表达 cox-2的非小细胞肺癌细胞株的凋亡抑制水平，认为非小细胞肺癌中 cox-2 依赖的 survivin 表达是凋亡抑制的关键。国内赵君宁在胃癌、刘江伟在胰腺癌、梁新军在骨肉瘤、魏欣在口腔鳞癌中都发现了survivin 和 cox-2 表达的相关性。本组实验 survivin 和 cox-2 在膀胱移行细胞癌中的表达明显相关，survivin 的表达程度随 cox-2 的表达程度而增高。推测二者可能具有共同
16、的激活机制或调节通路，而在膀胱移行细胞癌发生发展中起到协同或序贯作用。cox-2 的抗凋亡通路可能是通过上调 survivin 而实现的，但具体机制尚待进一步研究。本实验可望为以二者为靶点的基因诊断和治疗提供一定的依据。【参考文献】 1Tamm I, Wang Y, Sausville E, et al. IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by 9Fas (CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs J . Cancer Res, 1998, 58:5315-5320.2宋涛, 李鸣,石怀银,等. 凋亡抑制基
