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1、烟用添加剂中对乙氧基苯脲的测定 高效液相色谱法实验报告云南烟草科学研究院二一二年二月九日目 录1 前言 .41.1 对乙氧基苯脲简介 .41.2 理化性质 .41.3 检测方法综述 .41.3.1 薄层色谱法 .41.3.2 分光光度法 .51.3.3 气相色谱法 .51.3.4 毛细管电泳法 .51.3.5 液相色谱法 .61.4 小结 .72 标准适用范围 .83 原理 .84 试验方法 .84.1 仪器 .84.2 试剂与材料 .84.3 试样前处理 .94.4 高效液相色谱条件 .104.5 标准曲线制作 .104.6 试样测定结果 .115 结果与讨论 .115.1 色谱条件的选择
2、.115.1.1 检测器及波长的选择 .125.1.2 色谱柱的选择 .165.1.3 流动相的选择 .195.1.4 其它色谱条件的选择 .225.2 前处理步骤的选择及优化 .225.2.1 空白试验 .225.2.2 样品提取溶剂选择 .225.2.3 净化步骤的选择 .235.2.4 固相萃取条件选择及优化 .245.2.5 净化过程的回收率考察 .255.2.6 其它前处理条件的选择 .255.3 方法评价 .275.3.1 检出限和定量限 .275.3.2 精密度 .285.3.3 重复性 .285.3.4 储备液稳定性 .305.3.5 试样稳定性 .305.3.6 试样加标回收
3、率 .315.3.7 比对试验结果 .325.3.8 试样测定 .33参考文献 .34附件一 方法的检出限及定量限 .36附件二 试样中对乙氧基苯脲定性确认方法 .391 前言1.1 对乙氧基苯脲简介对乙氧基苯脲（4-Ethoxyphenyl-urea） ，俗名甘素（dulcin） ，亦称甘精，是一种人工合成甜味剂，甜度大约是蔗糖的 250 倍，1884 年被 Joseph Berlinerbau 发现。由于其与糖精钠相比没有后苦味，7 年以后作为人工合成甜味剂进行大批量生产，在 20 世纪初占有很大的市场，作为糖尿病患者的代糖。1951 年美国 FDA 对对乙氧基苯脲的安全性提出了质疑，19
4、54 年经过多次的动物实验证明了其能够水解成氨基苯酚而引发肿瘤，从而退出市场。对乙氧基苯脲在人体中的吸入、分布、代谢及排泄目前并无资料。经动物实验(兔与大鼠)结果显示：三小时內快速吸收进入血液，但排泄粪便中没有发现代谢物，除了脂肪之外的大部分组织中对乙氧基苯脲代谢消失都很慢。联合国粮农组织与世界卫生组织（FAO/WHO）建议每日容许摄取量：禁止使用。世界上大部分国家（美国、日本、中国台湾、中国香港）均禁止食品中使用对乙氧基苯脲。有研究表明，成人摄入 20-40 g 会头晕、恶心，并可能导致低血压与发绀和高铁血红蛋白血症。在我国，对乙氧基苯脲不在卫生标准 GB2760 允许使用的甜味剂名单范围内
5、。据文献报道 1，常在蜜饯食品中检验出对乙氧基苯脲的存在。1.2 理化性质对乙氧基苯脲是酰胺类物质，也是脲中的一类。化学式为 C9H12N2O2，CAS 号为：150-69-6。对乙氧基苯脲是具有金属光泽的白色针状晶体，分子量为 180.212，熔点：173-174 ，在水中的溶解度为 3.8 g/L3。可由对乙氧基苯胺盐酸盐和尿素加热反应制得，或者将对氨基苯乙醚与二氯化碳作用后，再加入氨气而制成 4。对乙氧基苯脲的分子结构式如下图：对乙氧基苯脲分子结构式1.3 检测方法综述目前能够检索到的检测方法主要包括：薄层色谱法、分光光度法、气相色谱法、毛细管电泳法、液相色谱法，下面就对乙氧基苯脲检测技
6、术发展情况分类介绍如下。1.3.1 薄层色谱法Kamp.W.等 9在 1966 年用薄层色谱技术分离并鉴定了对乙氧基苯脲、甜蜜素和糖精钠。1972 年 Ryuzo Takeshita10利用薄层色谱法检测食品中的甜味剂(糖精钠、甜蜜素和对乙氧基苯脲)，先用乙酸乙酯提取，硅胶和中性氧化铝柱净化，再经过聚酰胺色谱板分离，方法灵敏度范围 0.012g。1.3.2 分光光度法1.3.2.1 荧光分光光度法文献报道关于对乙氧基苯脲荧光分光光度检测方法，该类方法是基于增强对乙氧基苯脲荧光强度展开的一系列工作。Uchiyama S 11于 1969 年首次提出了用亚硝酸钠与对乙氧基苯脲作用，再用荧光分光光度
7、法检测食物中的对乙氧基苯脲。Sadao Uchiyama 12在 1972 年报道了用荧光分光光度法测定对乙氧基苯脲与亚硝酸钠反应得到的产物，该方法是在室温条件下，经过对乙氧基苯脲与亚硝酸钠和盐酸发生化学反应，混合的反应产物与氢氧化钠反应这两个步骤后，用氯仿提取、硅胶柱分离纯化，采用荧光分光光度计检测样品中的对乙氧基苯脲。Sadao Uchiyama131977 年具体介绍对乙氧基苯脲与亚硝酸钠的反应条件，如反应的温度，时间。还提出反应得到的产物的荧光性是对乙氧基苯脲的 5 倍，明显增强了对乙氧基苯脲的荧光性，检出限也比之前降低了 20 倍，用此方法测定苯胺类物质的衍生物，尤其是对位的苯胺类物
8、质、氨基苯乙醚时，可以提高方法灵敏度。1.3.2.2 紫外可见分光光度法1983 年，M.Veerabhadra Rao 等 14将对乙氧基苯脲在 6.0 mol NaOH 条件下进行水解，水解以后的对乙氧基苯脲在 pH=3.0 条件下被次氯酸钾氧化，然后在 pH=10.0 的条件下，与酚的作用下得到靛酚，该衍生物吸收波长为 630 nm，方法测定的浓度范围为 0.5-8.0 g/mL，回收率达到 99.5-100%。2000 年，美国 AOAC 17th 出台了官方方法 957.11规定了食品中对乙氧基苯脲的测定方法，方法分为快速显色定性方法和紫外分光光度比色定量方法 6，7 两个部分。其中分光光度法定量检测的对象是非酒精饮料，通过溶剂萃取纯化样品，分光光度计定量测定，检测波长为 294nm。1.3.3 气相色谱法1971年H.Konig 15采用气相色谱同时检测糖精、甜蜜素、对乙氧基苯脲。其中糖精和甜蜜素用重氮甲烷来进行衍生，其中对乙氧基苯脲则不需要衍生化处理，三种物质检出限达到分别为0.2,0.02和0.02g/mL。另据报
